研究背景

隨著農(nóng)業(yè)面積的減少和人口的增長(zhǎng)，糧食危機(jī)正成為一個(gè)日益嚴(yán)重的問題。沙漠約占地球陸地表面積的三分之一，是貧瘠的環(huán)境，幾乎沒有降水，通常有干燥和堿性土壤，因此對(duì)大多數(shù)植物和動(dòng)物的生活條件都很不利。然而，一些沙漠地區(qū)仍可以種植一些作物。洞察這些物種的環(huán)境適應(yīng)和經(jīng)濟(jì)特征，有助于在不同的沙漠地區(qū)種植和繁殖這些作物，這可能有助于緩解世界糧食危機(jī)。

開心果（p.vera，2n=30，圖1a）雙子葉植物綱、無(wú)患子目和漆樹科，是起源于中亞和中東的腰果家族成員。它是一種沙漠植物，對(duì)鹽漬土有很高的耐性。開心果最近成為第五大堅(jiān)果作物，除了具有經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值外，對(duì)非生物脅迫也有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，被認(rèn)為是一種能耐受干旱和鹽堿脅迫的物種，是干旱和鹽堿區(qū)重新造林的理想選擇。

盡管基因組測(cè)序的快速發(fā)展有助于發(fā)現(xiàn)許多作物馴化和改良的遺傳基礎(chǔ)，但關(guān)于開心果的研究卻很少。據(jù)估計(jì)，開心果的基因組大小約為600 MB，雜合率高。Moazzzam Jazi等人利用全基因組轉(zhuǎn)錄組，通過(guò)對(duì)照和鹽處理兩個(gè)開心果品種的比較，發(fā)現(xiàn)了耐鹽性相關(guān)的標(biāo)記物和應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。

在本研究中，為了更好地了解開心果馴化的分子進(jìn)化歷史，研究人員組裝了開心果的基因組草圖，并對(duì)107個(gè)全基因組進(jìn)行了重測(cè)序，包括93個(gè)馴化和14個(gè)野生的開心果以及35個(gè)不同野生黃連木屬物種。整合基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，擴(kuò)張的基因家族（如細(xì)胞色素P450和幾丁質(zhì)酶）和茉莉酸（JA）生物合成途徑可能參與應(yīng)激適應(yīng)。比較群體基因組分析顯示，開心果大約在8000年前被馴化，馴化的關(guān)鍵基因可能是那些涉及樹木和種子大小的基因，這些基因經(jīng)歷了人工選擇。這些基因組序列應(yīng)該有助于未來(lái)的研究，以了解沙漠作物的農(nóng)業(yè)和環(huán)境相關(guān)特性的遺傳基礎(chǔ)。

研究結(jié)果

991份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的再鑒定

?與參考基因組（“Darmor-bzh”）相比，在991個(gè)油菜基因組中檢測(cè)到556萬(wàn)個(gè)SNP和186萬(wàn)個(gè)InDels。（表1）。并檢測(cè)了它們?cè)诟仕{(lán)型油菜基因組區(qū)域的分布。比較A和C亞基因組之間的SNP分布顯示，A亞基因組中的SNP頻率（7.9?SNPs/kb）高于C亞基因組中的SNP頻率（5.9?SNPs/kb）。并將過(guò)濾后鑒定出的2753575個(gè)可信的SNPs（缺失數(shù)據(jù)<50%，MAF>5%）用于后續(xù)分析。

?表1 不同生態(tài)型油菜基因組多態(tài)性及變異

991個(gè)群體的群體結(jié)構(gòu)和基因組變異

991份油菜大致與它們的地理分布相對(duì)應(yīng)，即分別是歐洲、亞洲和歐亞大陸/北美(圖1A)。系統(tǒng)發(fā)育、種群結(jié)構(gòu)和主成分分析（PCA）結(jié)果表明，991份油菜品種可分為三組（K=3）（圖1BCD），大致相當(dāng)于冬季、半冬季和春季生態(tài)類型，說(shuō)明冬、半冬和春季生態(tài)型在遺傳上存在差異。與參考基因組“Darmor-bzh”相比，分別在冬、半冬和春季材料尋找SNPs與InDels。冬型的核苷酸多樣性(π=8.42×10^-4)低于半冬型(π=10.16×10^-4)和春型(π=9.92×10^-4)，表明在冬季類型中低頻SNPs的存在主要是由于“Darmor-bzh”（也是一種冬型種質(zhì)資源）的mapping所致。

進(jìn)一步分析連鎖不平衡在整個(gè)基因組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)冬、半冬和春季生態(tài)型SNPs之間的物理距離(最大值的一半)分別為11.27 kb(r²=0.30)、24.55 kb(r²=0.32)和17.40 kb(r²=0.31)。（圖1E）LD衰變的大小在不同染色體和不同亞基因組之間變化很大。在冬型、半冬型和春型基因組中分別檢測(cè)到100、5460和631個(gè)大的LD結(jié)構(gòu)（>10 kb），表明冬型油菜的遺傳重組頻率高于其它類型油菜的遺傳重組頻率，從而破壞了基因組LD結(jié)構(gòu)。此外，在A亞基因組中，LD衰變速率比在C亞基因組中更快，這表明A亞基因組中的遺傳重組頻率高于C亞基因組中的遺傳重組頻率（圖1F）。

圖1 991份油菜種質(zhì)資源的分布、種群結(jié)構(gòu)、PCA和LD衰變

主要種群間的等位基因漂移路徑

進(jìn)一步計(jì)算世界地圖上顯著的基因流數(shù)目之后，在冬型和春型油菜中發(fā)現(xiàn)了四個(gè)主要基因流（圖2C）。冬型油菜的基因流從法國(guó)到俄羅斯(weight=0.5)、法國(guó)到瑞典(weight==0.3)、波蘭到日本(weight==0.3)和日本到中國(guó)(weight==0.3)，而春型油菜的基因流從法國(guó)到俄羅斯（weight==0.5)、法國(guó)到瑞典。經(jīng)德國(guó)（weight=0.4），瑞典到加拿大（weight＝0.2），加拿大到中國(guó)（weight＝0.5）。沒有顯著的生態(tài)型漂移事件（inter-ecotype drift events）（圖2 A、B）。

圖2 基因漂移

甘藍(lán)型油菜自然選擇和人工選擇產(chǎn)生的信號(hào)

為了確定自然選擇和人工選擇對(duì)歷史上基因的改變，作者對(duì)三種生態(tài)型之間進(jìn)行選擇性清除分析。春冬季型、半冬和冬季型、春季和半冬型之間分別有61、56和64個(gè)選擇性清除（表1；圖4）。位于選擇性清除區(qū)域上的基因可能發(fā)揮重要作用。在Chr.A10上發(fā)現(xiàn)了最強(qiáng)的信號(hào)，該信號(hào)是冬春型之間基因組變化的基礎(chǔ)（圖3A）。該區(qū)域有56個(gè)帶注釋的基因，包括FLC直系同源基因(BnaA10g22080D)和AIL6直系同源基因(BnaA10g21750D)，編碼AP2-like乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(ERF)。在含有377個(gè)帶注釋基因的Chr.A02上發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)強(qiáng)選擇性信號(hào)，包括FT?(BnaA02g12130D)、FY?(BnaA02g01670D)、CONSTANS-like?(BnaA02g13920D)、ERF118?(BnaA02g13950D)和ERF118-like(BnaA02g13960D)以及組氨酸t(yī)ransporter-like 2乙烯轉(zhuǎn)運(yùn)體(BnaA02g13290D)。編碼幾個(gè)MADS-box基因的Chr.C01、C02、C08和C09上的一些區(qū)域顯示出弱清除信號(hào)。發(fā)現(xiàn)在有1404個(gè)基因在冬春兩季類型之間發(fā)生選擇性清除，這些基因包括花期控制、乙烯生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)以及植物應(yīng)激反應(yīng)的基因。此外，在半冬型和冬型之間以及春季型和半冬型之間的種群分化的清除區(qū)域內(nèi)共鑒定出1228和1370個(gè)基因。鑒定出許多與開花時(shí)間調(diào)控相關(guān)的基因，如CONSTANS-like和MADS-box基因，或植物激素信號(hào)傳導(dǎo)基因，如ERFs以及生長(zhǎng)素和赤霉素誘導(dǎo)基因。GO分析表明，這些基因涉及多種生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。

圖3 三種油菜生態(tài)型之間的選擇性清除信號(hào)

圖4三種生態(tài)型之間的遺傳多樣性和選擇性信號(hào)circos圖

甘藍(lán)型油菜開花時(shí)間相關(guān)基因的鑒定

開花期是油菜品種馴化和育種的重要性狀之一，也是油菜三個(gè)生態(tài)型的重要區(qū)別之一。觀察了不同品種之間的開花時(shí)間變化（125-191?d）。曼哈頓試驗(yàn)表明，在Chr.A02的4-7 Mb區(qū)域，許多SNPs與開花時(shí)間顯著相關(guān)（-log₁₀P>6）（圖3B和圖5）。在6.37～6.38?Mb區(qū)域內(nèi)鑒定了擬南芥FT（BnaA02g12130D）的直系同源序列，其中的SNPs與開花時(shí)間密切相關(guān)（圖5）。對(duì)100?kb（6.37～6.38Mb）序列進(jìn)一步的LD分析表明，與開花時(shí)間相關(guān)的SNPs位于FT直系同源起始密碼子的上游~3?kb（6372995～6375936 kb）（圖5A和5B）。

?圖5 Chr.A02上開花時(shí)間從約6.37?Mb-6.38?Mb的SNPs

BnaA10g22080D是擬南芥FLC的一個(gè)假定的同源基因，在Chr.A10的14.99-15.01 Mb之間的區(qū)域內(nèi)被鑒定（圖3B）。GWAS和LD分析表明，BnaA10g22080D的5’調(diào)控區(qū)的SNPs與品種間開花時(shí)間的變化顯著相關(guān)（圖6A和6B）。

?圖6 Chr.A10染色體上約14.99-15.00 Mb的花期SNPs

與“Tapidor”基因組進(jìn)行比對(duì)

為了驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性(即種群結(jié)構(gòu)、選擇信號(hào)和開花時(shí)間的GWAS分析)，通過(guò)將reads mapping到另一個(gè)“Tapidor”參考基因組進(jìn)行call SNPs。共獲得553萬(wàn)個(gè)SNPs和192萬(wàn)個(gè)InDels。群體結(jié)構(gòu)分析和PCA分析結(jié)果與mapping?“Darmor-bzh”參考基因組（簡(jiǎn)稱SNP-Darmor）的結(jié)果相同。比較了LD衰變率之間的“SNP-Darmor”和“SNP-Tapidor”，得到一致的結(jié)果。對(duì)開花時(shí)間的選擇性清除分析和GWAS分析證實(shí)，A02上的FT同源性(BnaA02g12130D)和A10上的FLC同源性(BnaA10g22080D)與開花時(shí)間變化顯著相關(guān)。從而得出：利用群體遺傳學(xué)方法，如PCA、LD率、選擇性信號(hào)和GWAS，對(duì)兩個(gè)SNP集（SNP-sets）進(jìn)行分析得出相同的結(jié)論。

生態(tài)型差異對(duì)應(yīng)的SNPs鑒定

FT和FLC直系同源基因編碼區(qū)的核苷酸序列在所有三種生態(tài)類型中都相當(dāng)保守。在BnaA02g12130D的5’上游地區(qū)32個(gè)SNPs中，10個(gè)SNPs在這三種生態(tài)類型之間有特異性差異。95±2%的冬型種質(zhì)在BnaA02g12130D起始密碼子上游上具有與參照(“Darmor-bzh”)相同的核苷酸，而在85±6%的春型種質(zhì)中，相應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸以不同的方式改變，如鳥嘌呤（G）向胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化以及腺嘌呤（A）向鳥嘌呤（G）的轉(zhuǎn)化。只有22±3%的半冬型品種與春型品種有相同的變化，其中40%的半冬型品種與春型品種有相似的T到C的變化。半冬型品種表現(xiàn)出與春型品種相似的核苷酸變化（圖5C）。

FLC直系同源基因推測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)(BnaA10g22080D)中各種SNPs的頻率在三種生態(tài)類型之間有很大差異(圖6C)。為了研究生態(tài)型特異性SNPs與甘藍(lán)型油菜FT或FLC轉(zhuǎn)錄是否相關(guān)，用FT?(BnaA02g12130D)和FLC?(BnaA02g12130D)的特異性引物對(duì)各種FT和FLC同源物的表達(dá)水平進(jìn)行了比較。結(jié)果和已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致表明：春季型品種葉片中BnaA02g12130D的表達(dá)水平顯著高于其他兩種生態(tài)型（圖5D），而BnaA10g22080D在春型品種葉片中的表達(dá)在所有三個(gè)生態(tài)型中都最低（圖6D）。與春、冬型品種間FT和FLC同源基因表達(dá)顯著差異相比，半冬型品種與其它兩種類型品種間的表達(dá)差異較?。▓D5D和6D）。這些結(jié)果表明，生態(tài)型特異性SNPs與FT和FLC同源物的表達(dá)水平相關(guān)，這有助于三種生態(tài)型間形成不同的開花時(shí)間。

在春與冬、春與半冬、半冬與冬的選擇性清除分析下，推測(cè)有12～15個(gè)乙烯基因。在Chr.A02上僅推測(cè)ERF119直系以及Chr.A10上推測(cè)的AP2-like ERF (AIL6)直系顯示與生態(tài)型差異相對(duì)應(yīng)的有區(qū)別的SNPs。這些生態(tài)型特異性SNPs與已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的ERF119和AP2-like ERF（AIL6）的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)，這使三種生態(tài)型表現(xiàn)出不同的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。

總結(jié)

該研究對(duì)991份油菜天然種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性的測(cè)序和鑒定。通過(guò)對(duì)兩個(gè)不同的參考基因組，即“Darmor-bzh”和“Tapidor”基因組的定位讀數(shù)產(chǎn)生的兩組SNPs的群體遺傳學(xué)分析，得出了一致的結(jié)論。遺傳多樣性和連鎖不平衡參數(shù)表明甘藍(lán)型油菜兩個(gè)亞基因組的進(jìn)化是不對(duì)稱的。選擇性掃描分析揭示了與調(diào)控植物發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)的各個(gè)方面相關(guān)的基因的遺傳變化。并對(duì)影響開花時(shí)間的SNPs進(jìn)行了探索。

整個(gè)研究科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)，為油菜分子標(biāo)記的篩選提供了重要依據(jù)，為油菜分子標(biāo)記在油菜育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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