該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開發(fā)針對(duì)微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。百邁客生物為該研究提供了全長16S?rRNA測序服務(wù)。

研究背景

IgA腎病（IgAN）是全球最常見的免疫介導(dǎo)的原發(fā)性腎小球疾病，每年每10萬成年人中至少有2.5例發(fā)病。具有顯著的終身進(jìn)展至終末期腎病（ESRD）的風(fēng)險(xiǎn)，約20%-40%的IgAN患者會(huì)在10至20年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病。因此迫切需要發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)和新的干預(yù)策略。

一般來說，人類腸道中居住著數(shù)以萬億的細(xì)菌，這些細(xì)菌以膳食營養(yǎng)為燃料，可合成多種生物活性化合物。這些微生物代謝物進(jìn)一步向體內(nèi)遠(yuǎn)處的器官發(fā)出信號(hào)，使它們能夠與激素和免疫系統(tǒng)以及宿主的新陳代謝及其他功能相連接，腸道與宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用影響著身體功能，這些功能將其與其他器官聯(lián)系起來，并導(dǎo)致它們之間形成“軸”。

慢性腎臟病通常是進(jìn)行性且不可逆的，腸道微生物群作為環(huán)境與人類之間的橋梁，在慢性腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著根本性作用。IgA?腎病（IgAN）與腸道微生物群的平衡息息相關(guān)。然而，目前還不清楚腸道微生物群的變化是否會(huì)減弱IgAN或影響其進(jìn)展。

研究結(jié)果

? IgAN引起腎損傷和腎功能下降

根據(jù)以上研究背景，作者首先確認(rèn)了IgAN小鼠模型的成功建立。通過分析小鼠腎臟IgA免疫熒光染色，與對(duì)照組相比，IgAN組腎小球IgA（p?<?0.001）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積顯著增加。PAS染色顯示，IgAN組腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多及基底膜增厚。腎功能指標(biāo)評(píng)估顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組小鼠血尿素氮（BUN）（p?<?0.001）、尿酸（UA）（p?<?0.01）、血清肌酐（Scr）（p?<??0.01）、血白蛋白（BAL）（p?<?0.05）及尿蛋白/肌酐比值（ACR）（p?<??0.001）水平顯著增加，IgAN組腎功能顯著下降，這可能與腎臟結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。

? IgAN引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡

通過構(gòu)建IgAN動(dòng)物模型，作者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，IgAN組的α多樣性分析均顯著降低。此外，采用非加權(quán)組平均法聚類（UPGMA樹）分析、非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行相似性聚類分析。結(jié)果顯示，IgAN組與對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的微生物聚類，兩組間存在清晰的分組，表明IgAN誘導(dǎo)了微生物群落的轉(zhuǎn)變。

為識(shí)別IgAN腸道微生物群的有效特征，作者進(jìn)行了LEfSe（線性判別分析效應(yīng)大小)。發(fā)現(xiàn)在屬水平上，IgAN組中另枝菌屬（Alistipes）、鏈球菌屬（Streptococcus）、文肯菌屬（Rikenella）、埃希氏菌屬（Escherichia?Shigella）和乳酸桿菌（Lactobacillus）的豐度顯著增加。

相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，IgAN誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡。

? IgAN引起腸道屏障損傷和腸道B細(xì)胞免疫失衡

隨后作者采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法評(píng)估了各組治療小鼠的結(jié)腸完整性，以確定IgAN引起的腸道通透性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組小鼠的黏膜上皮完整，固有層內(nèi)腺體豐富且排列致密有序，肌層結(jié)構(gòu)清晰。與此同時(shí)，IgAN模型小鼠的腸道腺體結(jié)構(gòu)疏松，局部出現(xiàn)松散，肌層增厚，并伴有輕微的淋巴細(xì)胞浸潤。此外，通過對(duì)腸道通透性指標(biāo)的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，IgAN組小鼠血清中的二胺氧化酶（DAO）（p?<?0.001）、D-乳酸（D-LA）（p?<??0.01）和脂多糖（LPS）（p?<?0.01）水平顯著升高，尤其是在DAO水平上，這表明IgAN模型小鼠的腸道通透性增加。

通過評(píng)估B細(xì)胞活化因子和IgA水平，企圖闡明了IgAN的免疫失衡機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組小鼠的B細(xì)胞活化因子（BAFF）（p?<??0.001）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）（p??<??0.001）水平顯著升高。IgA水平也異常升高（p?<?0.01），這表明B細(xì)胞過度活化導(dǎo)致IgA穩(wěn)態(tài)失衡。

總結(jié)來說，IgAN模型小鼠的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致其腸道屏障完整性降低和B細(xì)胞IgA分泌失衡。

? COS可重塑IgAN小鼠模型的菌群失調(diào)

隨后，作者為探索調(diào)節(jié)IgAN的特定微生物群是否能改善疾病進(jìn)展，應(yīng)用了COS對(duì)IgAN中失調(diào)的微生物群進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)。α多樣性比較結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量COS干預(yù)后，IgAN小鼠模型的腸道微生物群整體得到恢復(fù)。β多樣性分析（PCoA和PLS-DA）表明，與對(duì)照組相比，COS干預(yù)后的腸道微生物群表現(xiàn)出顯著改變，其結(jié)構(gòu)向?qū)φ战M方向轉(zhuǎn)變。

腸道微生物群組成分析顯示，不同劑量COS干預(yù)后富集的微生物群存在差異：COS-L組主要富集未分類的毛螺菌科（unclassified?Lachnospiraceae）、支原體屬（Anaeroplasma）、振蕩桿菌屬（Oscillibacter）、嗜木糖真桿菌群（Eubacterium?xylanophilum?group）和單球?qū)伲∕onoglobus）；而COS-H組主要富集未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、理研菌屬（Rikenella）、臭味桿菌屬（Odoribacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)：COS-L（低劑量殼寡糖）和COS-H（高劑量殼寡糖）均有效抑制了IgAN模型中顯著增加的微生物豐度，由此，實(shí)現(xiàn)了對(duì)IgAN模型腸道微生物群的反向平衡調(diào)節(jié)。

? 靶向微生物調(diào)控減輕腸道屏障損傷，并且對(duì)IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用

此外，作者進(jìn)一步探討了調(diào)節(jié)特定微生物群落對(duì)腸道屏障和黏膜免疫的影響。結(jié)果顯示，COS干預(yù)組顯著改善了腸道通透性指標(biāo)。對(duì)D-LA和LPS的改善效果呈劑量依賴性，其中COS-H組的改善效果最佳。陽性對(duì)照組也顯示出對(duì)IgAN模型引起的腸道損傷的改善。H&E染色還顯示，COS干預(yù)導(dǎo)致結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰完整，腸腺排列規(guī)則，趨于正?；?/p>

同時(shí)，COS干預(yù)緩解了IgAN模型中B細(xì)胞過度活化引起的IgA失衡。顯著降低了小鼠血清中BAFF（COS-L組，p?<??0.001；COS-H組，p?<?0.001）和APRIL（COS-L組，p?<?0.001；COS-H組，p?<?0.001）的水平。COS-H組的IgA水平顯著降低（p?<?0.05）?？偨Y(jié)來說，針對(duì)IgAN中特定微生物群落的靶向調(diào)節(jié)可抑制APRIL和BAFF的過表達(dá)，從而對(duì)IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

? IgAN患者糞菌移植會(huì)引起模型小鼠產(chǎn)生腎損傷

采用人類微生物群相關(guān)HMA-IgAN小鼠模型探討小鼠模型與人類微生物群的差異，并計(jì)劃驗(yàn)證IgAN誘導(dǎo)的人體腸道微生物群演變對(duì)小鼠腎功能的影響。腎免疫熒光顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球IgA（p?<?0.01）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積與IgAN模型小鼠觀察到的結(jié)果相似。PAS染色顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球系膜細(xì)胞顯著增生伴炎性浸潤，與IgAN模型組相似。與HMA-HC組相比，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出與IgAN模型相似的腎損傷，血尿素氮（BUN，p?<?0.05）、尿酸（UA，p?<??0.05）、血肌酐（Scr，p?<?0.001）和尿白蛋白/肌酐比（ACR，p?<?0.01）顯著升高。

這些結(jié)果表明，IgAN狀態(tài)下的腸道微生物群可誘導(dǎo)成功構(gòu)建IgAN小鼠模型，并導(dǎo)致宿主腎損傷，其損傷程度與IgAN小鼠模型觀察到的損傷相當(dāng)。

? HMA-IgAN小鼠模型重現(xiàn)了腸道菌群失調(diào)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：與HMA-HC組相比，HMA-IgAN組小鼠腸道微生物群的α多樣性顯著降低。β多樣性分析顯示，兩組的聚類之間存在明顯的分化。兩組的微生物群特征也存在顯著差異。在屬水平上，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出擬桿菌屬（Bacteroides）、未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、丹毒絲菌屬（Erysipelatoclostridium）和厭氧梭菌屬（Anaerofustis）的增加。相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，HMA-IgAN小鼠模型可以誘導(dǎo)腸道微生物群多樣性（ACE、Shannon和Chao1指數(shù)）的紊亂以及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

? COSF增加了HMA-IgAN小鼠模型腸道菌群多樣性，并且維持了腸道穩(wěn)態(tài)

最后，作者在IgA腎?。↖gAN）小鼠模型中，進(jìn)一步給予COS和COSF（殼寡糖制劑）進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)皆顯著增加了HMA-IgAN小鼠腸道微生物群的α多樣性指數(shù)，從而增加了腸道微生物群的豐富度。聚類結(jié)果顯示，HMA-IgAN組的樣本與對(duì)照組和干預(yù)組的樣本明顯分離，干預(yù)組樣本傾向于與對(duì)照組相似。采用LEfSe分析比較了HMA-HC組、HMA-IgAN組、COS干預(yù)組和COSF干預(yù)組之間的差異微生物群，并鑒定了各組的差異微生物群。在屬水平，COS可富集雙歧桿菌（Bifidobacterium）和羅斯氏菌（Roseburia）。COSF組富集的微生物群包括普氏菌（Alistipes）、未分類的振蕩螺菌科（Oscillospiraceae）、臭味桿菌（Odoribacter）、里肯氏菌（Rikenella）和未培養(yǎng)的瘤胃菌。

相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，結(jié)合前期介紹的IgAN模型組COS干預(yù)后的微生物變化，可得出結(jié)論：COS和COSF能夠平衡兩個(gè)模型中特定微生物群的失調(diào)。

? COSF可改善HMA-IgAN小鼠模型的腎功能修復(fù)

最后作者發(fā)現(xiàn)COS與COSF（殼寡糖制劑）皆顯著改善了HMA-IgAN小鼠模型的各項(xiàng)腎功能指標(biāo)，顯著降低了UA（p?<?0.05）、Scr（p?<?0.01）、BUN（p?<?0.05）和ACR（p?<?0.001）水平。

腎小球PAS染色結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)顯著降低了IgA（COS,?p?<??0.001;?COSF,?p?<?0.001）、C3（COS,?p?<?0.05;?COSF,?p?<?0.01）和IgG（COS,?p?<?0.01;?COSF,?p?<?0.01）的沉積，并對(duì)系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)張具有明顯的抑制作用，其中COSF組在腎小球系膜區(qū)增殖方面顯示出更顯著的改善。

總結(jié)來說，COSF干預(yù)可通過靶向調(diào)節(jié)HMA-IgAN小鼠模型內(nèi)的特定微生物群落來增強(qiáng)腎功能。

研究總結(jié)

該研究采用IgAN和人類微生物群相關(guān)模型來研究IgAN對(duì)腸道微生物群改變的影響以及腸道微生物群的可能會(huì)觸發(fā)?IgAN的機(jī)制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了殼聚糖?（COS）和COS制劑（COSF）具有微生物群靶向功能，可增強(qiáng)腸道屏障和腎功能的作用。這些結(jié)果表明，IgAN可導(dǎo)致α多樣性降低和腸道微生物群的結(jié)構(gòu)改變。同時(shí)，腸道也出現(xiàn)了B細(xì)胞免疫失衡和緊密連接蛋白水平降低（ZO-1和Occludin）。而COS/COSF可通過靶向調(diào)節(jié)富集腸道屏障和粘膜免疫相關(guān)微生物群來增強(qiáng)腸道ZO-1表達(dá)，減少B細(xì)胞活化因子（BAFF）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）過表達(dá)，從而減少IgAN中的腎損傷。

總之，該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開發(fā)針對(duì)微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。

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該研究為這一難題提供了全新解決方案：神經(jīng)肽SP（Substance?P）可通過重塑腸道菌群、促進(jìn)菌群代謝物肌醇生成，同步改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與焦慮樣行為。這項(xiàng)研究不僅首次闡明了“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體信號(hào)通路”的完整調(diào)控鏈，更以多組學(xué)技術(shù)與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其機(jī)制，為IBD合并精神障礙的治療開辟了新賽道。百邁客生物為該研究提供了非靶向代謝組和16S?rRNA測序服務(wù)。

研究背景

炎癥性腸病（IBD）包含潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是一種慢性腸道炎癥疾病，患者焦慮發(fā)生率高達(dá)?30%、抑郁發(fā)生率達(dá)?25%，但腸道外的精神癥狀常被忽視。腸-腦軸介導(dǎo)腸道炎癥與精神癥狀的關(guān)聯(lián)，腸道微生物群及其代謝物通過腸?–?腦軸調(diào)控腦功能，但硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的腸道菌群變化如何影響情緒相關(guān)中樞系統(tǒng)尚不明確。

神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）在腸-腦軸各層面均有表達(dá)，已被證實(shí)具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用，且能改善DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎，但SP是否通過腸道微生物群調(diào)控腸道屏障功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以改善焦慮樣癥狀，尚未明確。

研究結(jié)果

SP改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀

該研究采用DSS處理成功誘導(dǎo)出結(jié)腸炎小鼠模型。為評(píng)估SP在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用通過靜脈注射SP干預(yù)，從“腸道病理-腸道屏障-炎癥因子-行為學(xué)”?多維度驗(yàn)證SP的保護(hù)作用。

SP處理顯著降低疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），減輕體重下降，恢復(fù)結(jié)腸長度，降低脾臟?/?體重比。HE染色顯示，SP處理組結(jié)腸黏膜上皮完整、隱窩結(jié)構(gòu)正常，黏膜下層無明顯水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，組織學(xué)評(píng)分顯著低于DSS組；透射電鏡觀察到SP修復(fù)DSS導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞間隙增寬、微絨毛縮短卷曲。腸道屏障功能修復(fù)AB-PAS染色顯示SP緩解DSS誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞減少；免疫熒光證實(shí)SP上調(diào)腸道黏液屏障關(guān)鍵成分MUC-2的表達(dá)；FITC-葡聚糖檢測表明SP降低腸道通透性，減少外來物質(zhì)滲漏。Luminex檢測顯示，SP顯著降低結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎因子水平，且SP單獨(dú)處理組無明顯異常癥狀。

DSS撤藥后腸道炎癥消退，SP仍能改善殘留焦慮樣行為，表明其對(duì)腸腦軸的調(diào)控不依賴腸道炎癥緩解，具有獨(dú)立性。

圖1 SP改善DSS誘導(dǎo)小鼠的結(jié)腸炎癥狀及焦慮樣行為

SP可減輕DSS誘導(dǎo)小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥

海馬損傷可影響情緒調(diào)節(jié)中樞的功能，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁和焦慮等精神障礙。通過組織學(xué)染色、細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞因子檢測，探究SPSP在減輕神經(jīng)炎癥中的作用。

SP顯著減輕DSS誘導(dǎo)的海馬體神經(jīng)元丟失、核固縮、尼氏小體減少等病理損傷，維持神經(jīng)元形態(tài)完整。檢測了海馬組織中炎癥介質(zhì)的濃度，結(jié)果顯示，SP顯著降低了DSS處理小鼠海馬中IL-1β、?TNF?-α、IL-9、?IFN?-γ、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、?MIP?-1β和IL-12P70的水平，但提高了IL-4、IL-5和IL-10的水平，結(jié)果表明，SP通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子與抗炎因子之間的平衡，減輕了DSS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)炎癥。

為探究SP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，統(tǒng)計(jì)了各組海馬區(qū)這兩種細(xì)胞的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)SP減少DSS誘導(dǎo)的Iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化），增加GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（防止星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失）；Western?blot證實(shí)SP降低M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。合理推斷，SP通過減輕結(jié)腸炎小鼠海馬區(qū)的病理損傷和神經(jīng)炎癥，改善了其焦慮樣行為，這可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型極化及防止星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失有關(guān)。

圖2 SP減輕DSS誘導(dǎo)小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥反應(yīng)

SP改善DSS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)并改變微生物組功能

探究SP是否通過腸道菌群發(fā)揮作用，通過16S?rRNA測序分析SP對(duì)DSS誘導(dǎo)菌群失調(diào)的調(diào)控作用，結(jié)合PICRUSt2預(yù)測菌群代謝功能。

與DSS誘導(dǎo)組相比，SP對(duì)腸道菌群豐富度和多樣性均未產(chǎn)生顯著影響，PCoA分析顯示CON組、DSS組和DSS+SP組之間存在顯著差異，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在門水平，SP?顯著提高厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度，降低擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）豐度。在科水平，SP?增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、鼠桿菌科（Muribaculaceae）豐度，降低擬桿菌科（Bacteroidaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度。在屬水平，DSS+SP組中擬桿菌屬（Bacteroides）和擬桿菌亞屬（Alistipes）的相對(duì)豐度降低，而unclassified_Lachnospiraceae、unclassified_Muribaculaceae和?Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對(duì)豐度上調(diào)。PICRUSt2預(yù)測顯示，SP顯著激活肌醇磷酸代謝、膽汁分泌、NOD?樣受體信號(hào)通路等功能模塊，抑制戊糖磷酸途徑、生物膜形成等DSS誘導(dǎo)的異常功能模塊。

圖3 SP可改善DSS誘導(dǎo)小鼠的腸道菌群失調(diào)并改變微生物組功能

SP通過調(diào)節(jié)腸道菌群預(yù)防DSS誘導(dǎo)的腸道損傷及焦慮樣障礙

為驗(yàn)證腸道菌群是否為SP發(fā)揮作用的必需環(huán)節(jié)，進(jìn)行了抗生素耗竭實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。ABX處理14天成功構(gòu)建偽無菌小鼠模型后，SP對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀（DAI、體重、結(jié)腸長度、腸道結(jié)構(gòu)）和焦慮樣行為的改善作用顯著減弱，表明SP的保護(hù)作用依賴腸道菌群。

同時(shí)進(jìn)行了糞便微生物移植（FMT）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)MT-DSS+SP組表現(xiàn)出更輕的體重下降、更低的DAI、緩解結(jié)腸縮短以及降低的脾臟/體重比，腸道黏膜損傷減輕，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，TNF-α、IL-6等促炎因子水平降低，MPO活性減弱。FMT-DSS+SP組小鼠海馬神經(jīng)元損傷也得到了緩解，促炎因子（TNF-α、IL-1β）mRNA表達(dá)降低，抗炎因子IL-4表達(dá)升高，小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型（iNOS、CD80）表達(dá)降低，M2表型（CD206）表達(dá)升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)上調(diào)。此外腸道菌群結(jié)構(gòu)也與FMT-DSS組存在顯著差異，厚壁菌門、未分類鼠桿菌科等有益菌群豐度升高，擬桿菌屬等有害菌群豐度降低。

直接證實(shí)SP的保護(hù)作用依賴腸道菌群，排除SP直接穿過血腦屏障發(fā)揮作用的可能，明確菌群是SP調(diào)控腸腦軸的核心“中間人”。

圖4 SP以腸道微生物群依賴性方式預(yù)防DSS誘導(dǎo)的腸道損傷及焦慮樣障礙

圖5 FMT實(shí)驗(yàn)表明SP通過調(diào)節(jié)腸道菌群減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎和焦慮樣行為

SP通過調(diào)控腸道菌群影響海馬基因表達(dá)，涉及NF-κB和GABAergic/Ca2?信號(hào)通路

通過轉(zhuǎn)錄組測序分析FMT處理小鼠海馬體的差異表達(dá)基因，結(jié)合WB、免疫熒光染色，明確SP調(diào)控菌群后對(duì)腦內(nèi)信號(hào)通路的影響。

RNA-seq顯示，F(xiàn)MT-DSS與FMT-CON組存在436個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），F(xiàn)MT-DSS+SP組與FMT-DSS組存在387個(gè)DEGs，其中158個(gè)基因?yàn)楣餐{(diào)控基因。KEGG分析顯示DSS組NF-κB通路激活，而SP通過菌群抑制其激活。qRT-PCR和Western?blot證實(shí)，SP降低海馬組織中IKBα、p65?的mRNA表達(dá)及p-p65、p-IKBα的蛋白表達(dá)；免疫熒光顯示SP減少小膠質(zhì)細(xì)胞中p-IKBα陽性信號(hào)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB通路激活。KEGG分析顯示SP激活神經(jīng)活性配體-受體相互作用和Ca2?信號(hào)通路。qRT-PCR顯示SP上調(diào)海馬組織中Gabra1、Gabra3、Gabrb2、Camk2d等基因表達(dá)；Western?blot證實(shí)SP增加GABA_A?Rα1、GABA_B?R2、GAD65（GABA?合成關(guān)鍵酶）和CaMKII（鈣濃度傳感器）的蛋白表達(dá)。

免疫熒光顯示SP增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GABA_A?Rα1和CaMKII的陽性表達(dá)；流式分選細(xì)胞RNA-seq顯示，SP抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)基因富集，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GABA能突觸和鈣信號(hào)通路相關(guān)基因富集。

圖6 SP通過調(diào)節(jié)腸道微生物組影響海馬基因的表達(dá)

SP增強(qiáng)腸道微生物源性代謝物肌醇的富集

腸道菌群通過代謝物介導(dǎo)腸腦軸溝通，采用非靶向代謝組學(xué)分析DSS、DSS+SP、CON三組小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物代謝譜，篩選SP調(diào)控的關(guān)鍵代謝物。

PLS-DA分析顯示，三組代謝譜存在顯著分離，DSS+SP組代謝表型更接近CON?組，表明SP可逆轉(zhuǎn)?DSS?誘導(dǎo)的代謝紊亂。共鑒定出395個(gè)差異代謝物，其中肌醇（inositol）是SP干預(yù)后升高最顯著的代謝物之一，且富集于肌醇磷酸代謝、半乳糖代謝等通路。

Spearman相關(guān)性分析顯示，肌醇水平與有益菌群呈正相關(guān)，與結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，提示肌醇可能是菌群介導(dǎo)?SP?保護(hù)作用的關(guān)鍵?“信使分子”。

圖7 SP可增強(qiáng)腸道微生物群源代謝物肌醇的富集

肌醇給藥可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎及焦慮樣障礙

通過飲水給予DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠2%肌醇干預(yù)，驗(yàn)證肌醇是否能單獨(dú)模擬SP的雙向保護(hù)作用。

肌醇顯著抑制DSS誘導(dǎo)的體重丟失和DAI升高，恢復(fù)結(jié)腸長度，修復(fù)腸道上皮損傷，上調(diào)E-cadherin，降低結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)。肌醇處理組在開放場試驗(yàn)中移動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域活動(dòng)增加，在高架十字迷宮中開放臂停留時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)增加，焦慮樣行為緩解。肌醇緩解?DSS?誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元核固縮和尼氏小體丟失，降低海馬組織中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）mRNA?表達(dá)，升高抗炎因子IL-10表達(dá)；減少Iba-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)GABA合成與受體表達(dá)，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞及GAT1免疫陽性表達(dá)。而單獨(dú)補(bǔ)充肌醇組與對(duì)照組（CON）相比，未觀察到明顯的腸道病理學(xué)和行為學(xué)改變。綜上，這些數(shù)據(jù)表明肌醇可能是SP發(fā)揮有益效應(yīng)的關(guān)鍵候選代謝物。

圖8 腸道代謝物肌醇介導(dǎo)SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎及焦慮行為的保護(hù)作用

肌醇在SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

用肌醇合成抑制劑L-690330干預(yù)，驗(yàn)證肌醇是否為SP發(fā)揮作用的必需分子；同時(shí)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證肌醇對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接調(diào)控作用。

L-690330處理后，SP對(duì)DSS小鼠的抗焦慮作用及海馬體保護(hù)效應(yīng)被顯著逆轉(zhuǎn)。肌醇水平升高：FMT-DSS+SP組小鼠海馬體與血清中肌醇濃度顯著高于FMT-DSS組，證實(shí)菌群衍生的肌醇可進(jìn)入血液循環(huán)并作用于大腦。體外細(xì)胞驗(yàn)證：①?小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）：100μM肌醇可顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6?等促炎因子表達(dá)，無細(xì)胞毒性；②?星形膠質(zhì)細(xì)胞（C8D1A）：肌醇可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的GABA受體及CaMKII蛋白表達(dá)下調(diào)，激活GABAergic/Ca2?信號(hào)通路。

明確肌醇在SP調(diào)控通路中的“不可替代”地位，同時(shí)證實(shí)肌醇可直接調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞功能，完善“菌群代謝物?–?腦”的調(diào)控鏈條。

圖9 肌醇在SP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

研究總結(jié)

SP通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌群產(chǎn)生肌醇；肌醇進(jìn)入循環(huán)后作用于海馬體，一方面抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB促炎通路，減輕神經(jīng)炎癥；另一方面激活星形膠質(zhì)細(xì)胞GABAergic/Ca2?信號(hào)通路，增強(qiáng)抗焦慮神經(jīng)傳導(dǎo)；最終實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸炎的腸道保護(hù)與焦慮樣行為的神經(jīng)調(diào)節(jié)，形成“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體”的完整調(diào)控軸。

褪黑素通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群預(yù)防肥胖

IF：9.314 期刊：Journal of Pineal Research

時(shí)間：2017.03

單位：北京師范大學(xué) 、百邁客生物科技

研究背景

肥胖是一個(gè)非常嚴(yán)重的健康威脅因素，在2014年全球體重超標(biāo)的成年人達(dá)到20億，其中至少有6億是肥胖癥。有大量研究表明肥胖是癌癥和一些慢性疾病，如糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等的風(fēng)險(xiǎn)因素?，F(xiàn)如今肥胖已經(jīng)超越吸煙，成為世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的健康威脅。目前研究表明腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生。已有研究揭示褪黑素可以促進(jìn)體重的下降以及自身能量的平衡，但是褪黑素的益生作用是否與腸道微生態(tài)有關(guān)，目前尚未報(bào)導(dǎo)。而本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素是通過改變腸道微生物結(jié)構(gòu)來預(yù)防肥胖及其并發(fā)疾病。

研究方法

小鼠隨機(jī)分為3組，NCD（正常膳食）、HFD（高脂肪膳食）、HFD+M（高脂肪膳食+褪黑素）

Illumina?MiSeq；16S?rRNA?V3+V4;

組織學(xué)分析，生化分析，葡萄糖和胰島素耐受分析，蛋白質(zhì)印記分析。

研究成果

1，?褪黑素能顯著地控制體重增加

1）?HFD組小鼠體重顯著增加，而HFD+褪黑素組小鼠體重得到有效控制，如下圖A。

2）分離小鼠四類主要的脂肪組織（Epi-WAT、Mes-WAT、Per-WAT、Ing-SAT），發(fā)現(xiàn)HFD顯著促進(jìn)這四類脂肪組織重量的增加，而褪黑素能有效抑制這四類脂肪組織重量的增加，如下圖B-E。

2，?褪黑素能控制白色脂肪組織，脂肪肝，系統(tǒng)性炎癥

1）?通過比較Epi-WAT脂肪細(xì)胞的大小，發(fā)現(xiàn)HFD組脂肪細(xì)胞顯著增大；而褪黑素通過減少>12000μm2的細(xì)胞數(shù)目，增加2000–8000μm2的細(xì)胞數(shù)目，使HFD+褪黑素組脂肪細(xì)胞大小維持在正常范圍內(nèi)，如下圖A-C。

2）?通過比較Epi-WAT脂肪生成基因（FAS和ACC-1）的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HFD顯著促進(jìn)FAS和ACC-1的表達(dá)，而褪黑素顯著抑制FAS基因的表達(dá)，如下圖D和E。

3）?通過觀察油紅O染色及比較肝臟TC含量，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著抑制肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累，如下圖F和G。

4）?通過比較血液內(nèi)毒素（LPS）和炎癥性細(xì)胞因子（TNFα和IL-6）的水平，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著抑制內(nèi)毒素血癥和系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，如下圖H-K。

3，?褪黑素能改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性

1）?通過比較血脂含量，發(fā)現(xiàn)HFD顯著提高TG和TC含量，而褪黑素能顯著降低TG和TC的含量，如下圖A和B。

2）?通過比較血糖和胰島素含量，并推導(dǎo)HOMA-IR和QUICKI指數(shù)，發(fā)現(xiàn)褪黑素能有效保護(hù)胰島素敏感性，并且使血糖和胰島素的含量發(fā)生顛倒，從而使HOMA-IR和QUICKI指數(shù)趨于正常水平，如下圖C-F。

3）?通過葡萄糖耐受試驗(yàn)（IPGTT）和胰島素耐受試驗(yàn)（ITT）分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性，如下圖G和H。

4，?褪黑素能促進(jìn)棕色脂肪組織褐變及產(chǎn)熱

1）?通過棕色脂肪組織（BAT）石蠟切片分析，發(fā)現(xiàn)HFD促進(jìn)脂質(zhì)積累（切片白化），而褪黑素表現(xiàn)出相反的作用，并且褪黑素促進(jìn)BAT中UCP1蛋白的表達(dá)，如下圖A。

在BAT中，褪黑素顯著增強(qiáng)產(chǎn)熱基因UCP1和UCP3的表達(dá)，如下圖B和C；線粒體生物合成基因PGC1α，脂肪酸分解代謝基因CPT1β，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因CD36?和FABP的表達(dá)量也有提高，盡管未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性，如下圖D-G。

5，?褪黑激素改變腸道微生物結(jié)構(gòu)

1）?通過對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著降低OTU的數(shù)目以及微生物的豐富度和多樣性，如下圖A-H。

2）?門水平菌落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)HFD顯著降低擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度，而顯著提高厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度。而褪黑素的加入會(huì)降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，并且會(huì)顯著提高疣微菌門（verrucomicrobia）的相對(duì)豐度，如下圖I。

3）?屬水平菌落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著提高Akkermansia的相對(duì)豐度，Akkermansia屬于疣微菌門（verrucomicrobia），如下圖J。

4）?UPGMA、NMDS、PCA、PCoA分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu)，如下圖K-N。

6，褪黑素能調(diào)節(jié)腸道菌群中的標(biāo)志微生物

1) ?如下圖顯示，在三個(gè)分組中一共找到85個(gè)相對(duì)豐度有顯著差異的OUT。與NCD組相比，HFD組有27個(gè)相對(duì)豐度顯著增高的OTU，42個(gè)顯著降低的OTU。與HFD組相比，添加了褪黑素的組有10個(gè)相對(duì)豐度顯著增高的OTU，20個(gè)顯著降低的OTU；而在這30個(gè)差異性的OTU中，有14個(gè)OTU的變化方向與和NCD組比較的結(jié)果完全相反。這14個(gè)OTU屬于Ruminococcaceae、Desulfovibrionaceae、Bacteroides、Porphyromonadaceae、Helicobacteraceae、Christensenellaceae，有研究表明這些微生物與肥胖相關(guān)。

2) LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著提高Akkermansia的相對(duì)豐度，Akkermansia即是降低高脂肪膳食小鼠體重的有益菌。而褪黑素顯著降低Alistipes、Anaerotruncus、Helicobacter?marmotae的相對(duì)豐度，則這三種細(xì)菌預(yù)防肥胖的有害菌?？傊?，褪黑素能夠使高脂肪膳食小鼠的腸道菌群由失調(diào)狀態(tài)轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)，從而抑制體重的增加。

參考文獻(xiàn)：

Xu?P,?Wang?J,?Hong?F,?et?al.?Melatonin?prevents?obesity?through?modulation?of?gut?microbiota?in?mice[J].?Journal?of?Pineal?Research,?2017.