?在AD的過往研究中，大家發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊周圍存在復(fù)雜的炎性樣改變，但我們對這種反應(yīng)的分子變化和細(xì)胞間的相互作用知之甚少。本文利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究一個AD小鼠模型，可以分辨淀粉樣斑塊周圍直徑為100μm的組織結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄變化。實驗數(shù)據(jù)證實了一個早期髓鞘和OLIGs富集的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)變化，以及一個涉及補體系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、溶酶體、炎癥的PIGs多基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。作者進(jìn)一步通過人鼠大腦切片的原位測序在細(xì)胞水平證實了觀察到的大部分改變。可以說全基因組空間轉(zhuǎn)錄組分析為AD和其他腦部疾病提供了一種方法來解密致病特征附近的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)異常。

研究背景

NGS技術(shù)飛速發(fā)展，在生理和病理方面定義細(xì)胞狀態(tài)得到巨大進(jìn)步。例如，在AD領(lǐng)域，我們現(xiàn)在知道小膠質(zhì)細(xì)胞對β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊表現(xiàn)出典型的活化反應(yīng)。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞比小膠質(zhì)細(xì)胞更難分離，但單細(xì)胞核是一個合適的選擇。這些細(xì)胞的胞質(zhì)mRNA不能很好的展示，而且解離手段誘導(dǎo)了人為的表達(dá)改變。基本的問題還是，丟失了大部分的空間信息，包括細(xì)胞和淀粉樣蛋白斑的關(guān)系。而空間轉(zhuǎn)錄組可以解決這一問題，它的空間標(biāo)簽陣列可以記錄測序分子的空間位置，無偏地分析組織上的轉(zhuǎn)錄本信息。

目前AD研究的一個中心問題是淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)退行性進(jìn)程的關(guān)系。這個斑塊可能是AD的觸發(fā)器或者驅(qū)動器。遺傳分析表明，散發(fā)性AD的風(fēng)險與小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的對淀粉樣蛋白沉積有響應(yīng)的基因有關(guān)，但是星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞也對蛋白斑有分子響應(yīng)?！癆D的細(xì)胞相變”研究致力于綜合地了解這些細(xì)胞間漸變的復(fù)雜相互作用，這也確定了Aβ沉積引發(fā)的致病結(jié)果。然而，我們對淀粉樣斑塊附近細(xì)胞中發(fā)生的分子變化依然知之甚少。

 

研究方法

一、?實驗材料

人組織：AD晚期和正常對照大腦，女性（75歲左右）

鼠：?App^NL-G-F?KI、C57BL/6J，雄性

二、?實驗技術(shù)

空間轉(zhuǎn)錄組測序、原位測序

三、?實驗流程

實驗結(jié)果

作者使用3、6、12、18月齡的App^NL-G-F和C57BL/6小鼠大腦進(jìn)行冷凍切片，每只切三片，外側(cè)做免疫組化，中間做ST（圖1A）。每個冠狀切面包含500多個TDs的轉(zhuǎn)錄譜，20個切片合計10327個轉(zhuǎn)錄譜。并對每個TD進(jìn)行了空間、病理和細(xì)胞信息的注釋。實驗中每個TD檢測到31283± 7,441個唯一分子標(biāo)簽和6,578 ± 987唯一基因。作者將每個冠狀切片與艾倫小鼠大腦圖譜鑒定的14個解剖大腦區(qū)域進(jìn)行匹配(圖1B),并且每一個TD都被分配其中。TDs的數(shù)量介于112（內(nèi)嗅皮層ENTI）和2114（丘腦TH）之間（圖1B）。最后將三張切片整合，用Aβ負(fù)荷（6E10染色）、反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）、神經(jīng)元（NeuN）以及細(xì)胞核（DAPI）對其進(jìn)行注釋。

 

圖1 | 成年小鼠大腦的空間轉(zhuǎn)錄圖譜

 

一、?成年小鼠大腦的空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

作者對10327個轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行t-SNE分析聚類（圖1C），并且對年齡和基因型也進(jìn)行了很好的區(qū)分（圖1D）。分區(qū)結(jié)果表明了ST技術(shù)可以清晰地分辨出大腦解剖區(qū)域。野生型（WT）的斑點在12月齡和18月齡有所重疊（圖1D紫色和紅色），而App^NL-G-F的轉(zhuǎn)錄譜在這兩個時間點一直改變（黃色和綠色），這也與這段時期的病理進(jìn)展一致。

二、?將基因表達(dá)變化與Aβ沉積進(jìn)行關(guān)聯(lián)

App^NL-G-F小鼠的淀粉樣沉積從3月齡左右開始（圖2A）。在18月齡的切面上，78.5–4,950 μm²區(qū)域內(nèi)有1,565 ± 167個斑塊。單個TD的直徑是100 μm,切片厚度也是100 μm。因此，有理由認(rèn)為中間切片的細(xì)胞接觸到了鄰近切片檢測到的淀粉樣斑塊。作者使用一個TD上的Aβ像素?zé)晒鈴姸鹊臉?biāo)準(zhǔn)偏差作為Aβ指標(biāo)。這種方式可以區(qū)分輕微的和強烈的Aβ堆積（圖2B）。作者平均了每個腦區(qū)TD的Aβ指標(biāo)（圖2C），這與Aβ免疫染色一致，說明Aβ從背部往腹部皮層、丘腦、海馬區(qū)進(jìn)展。

為了解基因表達(dá)的變化，作者進(jìn)行了兩個差異表達(dá)分析。首先比較App^NL-G-F?和 C57BL/6（基因模型），其次是Aβ沉積對基因表達(dá)的影響（Aβ模型）。作者使用6個轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行經(jīng)典的RNA原位雜交實驗來驗證Aβ模型（圖2D&E），根據(jù)模型，18月齡的App^NL-G-F，Cst7，Cd68，C1qa，Slc1a3，Clu和Mbp表達(dá)異常。在圖2D中可以看到,ST的數(shù)據(jù)和RNA原位雜交數(shù)據(jù)高度相關(guān)，這也證實了本方法的有效性。

具有相似表達(dá)模式的基因很可能擁有相似的功能，因此可以通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）進(jìn)行模塊聚類。作者研究了10327個轉(zhuǎn)錄譜中變化程度*大的50%的基因，識別出12個模塊，并使用GOrilla提取了可能的生物學(xué)功能、Aβ暴露的表達(dá)變化、3月齡和18月齡的基因型、細(xì)胞特征、受影響的腦區(qū)。

三、?PIG模塊的鑒定

WGCNA分析中紫色的模塊被稱為PIGs，在18個月齡時，它在Aβ和基因型軸上*活躍（圖S3B）。這個模塊包含57個基因，開始時微微上調(diào)（圖3A），6-12月時在整個大腦中急劇增加至一種穩(wěn)定的狀態(tài)（圖3B）。18月齡App^NL-G-F小鼠的所有TDs在Aβ沉積和PIG中間存在一個中等但顯著的相關(guān)性（圖3C）,說明PIG表達(dá)隨著整個大腦中Aβ的沉積逐漸增加。

根據(jù)GO分析，作者得出該模塊參與了經(jīng)典補體級聯(lián)，以及補體級聯(lián)觸發(fā)的效應(yīng)機制，如內(nèi)吞作用，溶酶體降解、抗原處理和遞呈、免疫應(yīng)答和氧化還原過程。

作者進(jìn)一步研究了PIG模塊的細(xì)胞學(xué)特征，鑒定出其與激活的小膠質(zhì)細(xì)胞（疾病相關(guān)DAM或者激活響應(yīng)的ARM）和炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞（A1）有關(guān)聯(lián)（圖S3D）。重點突出了5個與A1標(biāo)記重疊的PIGs和15個DAM/ARM 基因（圖3D）。另外36個PIGs以前并沒有被定義為疾病相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)基因。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了前十的聯(lián)系*緊密的樞紐基因（圖3D,紅色）。作者評估這些PIGs是否可以在人數(shù)據(jù)庫中被鑒定出來。在41個細(xì)胞亞群中，與PIGs*相關(guān)的是AD相關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Mic1，圖S3E）。作者通過參與Aβ暴露和基因型的人Mic1??Marker基因的同源序列來放大基因表達(dá)變化（圖3E&F,橙&綠）。對小鼠的分析表明，人腦中的Mic1反應(yīng)是對淀粉樣蛋白斑塊的大量的多細(xì)胞協(xié)調(diào)反應(yīng)的一部分，而且這種反應(yīng)會隨著時間的推移而演變。

圖S3 | GO分析和WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

圖3?| Aβ斑塊誘導(dǎo)基因（PIGs）的鑒定

 

四、?使用原位測序在細(xì)胞分辨率下研究PIG模塊

ST展示了淀粉樣蛋白斑周圍的多細(xì)胞反應(yīng)，作者尋求一種正交獨立方法從單細(xì)胞分辨率下進(jìn)行驗證。原位測序（ISS）可以在一個反應(yīng)中使用許多靶向特異的原位標(biāo)簽。作者使用了特制的探針來繪制PIGs表達(dá)以及細(xì)胞類型標(biāo)簽（Itgam、 Cx3cr1、Csf1r對應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞;Slc1a3、Gfap 、Clu對應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞; Syp對應(yīng)神經(jīng)元; Plp1對應(yīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞；圖4A-C）。ISS實驗中，對App^NL-G-F和兩只18月齡WT小鼠各構(gòu)建兩個文庫。用每個基因的熒光點數(shù)目來量化基因表達(dá)，并將熒光點聚類到淀粉樣蛋白斑周位的5個同心圓上（圖4D）。51/54個PIGs在圈1上明顯富集，而C1qb在圈1上明顯減少（圖4E）。ISS的結(jié)果與ST的結(jié)果線相關(guān)性非常好（圖4E）。

作者開發(fā)了一種算法來檢測PIG網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞特征，通過計算5μm半徑內(nèi)的細(xì)胞類型Marker斑點的富集來匹配每個斑點到細(xì)胞型。通過預(yù)測每個Marker基因的細(xì)胞類型來驗證這個算法（圖4G）。很明顯，PIG響應(yīng)Aβ，這主要是因為小膠質(zhì)細(xì)胞，小部分由于星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖4H）。而一些PIGs在多種細(xì)胞類型中明顯富集。例如，Cyba在小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。

最后，作者使用RNA原位雜交，驗證18月齡App^NL-G-F的補體部分（C1qa、C4、 Clu)表達(dá)。實驗證實了C1qa在Itgam陽性細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞）中表達(dá)，Clu在?Slc1a3陽性細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞）表達(dá)，C4在Mbp陽性細(xì)胞（少突膠質(zhì)細(xì)胞）表達(dá)，這些細(xì)胞緊挨淀粉樣蛋白斑。這三個補體部分的細(xì)胞特征經(jīng)過RNA原位雜交檢測，與ISS分析結(jié)果一致。

 

圖4 | ISS鑒定的PIGs細(xì)胞標(biāo)簽

 

五、?PIG模塊中小膠質(zhì)細(xì)胞基因和星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的共表達(dá)

為了探究PIGs在不同細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性在多大程度上是由累積的Aβ病理驅(qū)動的，作者僅在PIGs上使用WGCNA分析，根據(jù)Aβ標(biāo)簽分離所有ST的TDs為WT和四個AD分位數(shù)（圖5）。WGCNA生成了一個連接矩陣，表明每個基因的改變是如何與其他所有基因的關(guān)聯(lián)的。圖5展示了隨著Aβ暴露，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)逐漸形成。

在WT中，所有PIGs的關(guān)聯(lián)相對較低，PIG被分為三個簇（圖5，綠、藍(lán)、橙）。ISS實驗（圖4H）證明了在綠色簇中，星形膠質(zhì)細(xì)胞基因（7/12）富集，而藍(lán)色（14/23）和橙色（14/28）簇聚集了小膠質(zhì)基因中表達(dá)的PIGs。在WT中，橙色的PIGs幾乎不關(guān)聯(lián)，而App^NL-G-F小鼠中，在接觸增長的Aβ后，這些PIGs的基因被招募。隨著Aβ指標(biāo)增長，PIGs內(nèi)部和相互之間的關(guān)聯(lián)增強。在Q4-Q1中，隨蛋白斑積累程度增加，互作關(guān)系明顯增加。

 

圖5 | 隨Aβ沉積，PIGs逐漸共表達(dá)

 

六、?少突膠質(zhì)細(xì)胞模塊的不同區(qū)域反應(yīng)

第二個變化比較大的模塊（紅色），在WGCNA(圖S3B)，由165個基因構(gòu)成，他們主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，因此命名為“OLIG模塊”。這個模塊最富集的功能種類是GO:0007272包膜神經(jīng)元、GO:0043209髓鞘、GO:0008366軸突包膜以及GO:0042552髓鞘形成。模塊最富集的10個基因是髓鞘相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本：Plp1、Mbp、Mobp、Cldn11、Mal、Apod、Cnp、Trf、Fth1、Plekhb1。比較OLIG與過往發(fā)表的小鼠單細(xì)胞數(shù)據(jù)，少突膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)聯(lián)很強（圖S3C）,活化小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM/ARM）輕度關(guān)聯(lián)（圖S3E）。OLIG與人AD相關(guān)的少突膠質(zhì)細(xì)胞Oli0關(guān)聯(lián)密切（圖S3E）。作者突出標(biāo)記了20個人類Oli0 markers同源序列（圖6A&B，橙色、綠色）。幾個Oli0同源序列與OLIG模塊同步上調(diào)和下調(diào)。

類似于髓鞘類（圖S3A）,與3月齡和18月齡的WT小鼠相比，App^NL-G-F小鼠在OLIG模塊的基因型軸線全腦范圍上全部上調(diào)（圖6A&6B）。這種基因型效應(yīng)可能反映了小鼠大腦對人源和突變的App基因的整體反應(yīng)。但是，從基因型中把Aβ暴露（Aβ軸）分理出后，作者發(fā)現(xiàn)了一個OLIG模塊的有趣變化：在3個月時，全部呈正相關(guān)，在18個月時為負(fù)相關(guān)（圖6A&6B）。在不同的大腦區(qū)域，這種反應(yīng)也有明顯的差異（圖6C）。比較圖2C中淀粉樣蛋白斑和OLIG表達(dá)，可以明顯發(fā)現(xiàn)OLIG表達(dá)的主要驅(qū)動因素不是Aβ指標(biāo)而是大腦區(qū)域本身（圖6C）。在3月齡時，作者發(fā)現(xiàn)在纖維束（FB）、丘腦（TH）和下丘腦（HY）中顯著的OLIG-Aβ正相關(guān)，而在內(nèi)嗅皮層（ENTI）和幾個海馬體皮層中存在顯著負(fù)相關(guān)。在18月齡時，作者在聽覺區(qū)域（AUDS）發(fā)現(xiàn)了OLIG-Aβ存在明顯負(fù)相關(guān)，而在ENTI和海馬體中存在顯著正相關(guān)。

作者進(jìn)而更詳細(xì)地從Aβ指標(biāo)和OLIG表達(dá)的關(guān)系方面分析這些區(qū)域的不同。在圖2中，Aβ沉積隨疾病的進(jìn)展而不同。甚至在3個月時，有些TDs暴露于Aβ（圖5，Q1中179個TDs）。隨著Q4-Q2中TDs的Aβ緩慢增長，OLIG表達(dá)增加（圖6D）。但是，三月齡有著*高Aβ暴露（Q1，比Q4中Aβ高21倍）的TDs中OLIG的表達(dá)存在一種降低的趨勢。另外，低Aβ暴露的TDs中OLIG模塊的基因?qū)Φ倪B接強度之和*強。為了進(jìn)一步證明發(fā)現(xiàn)，作者對三月齡App^NL-G-F小鼠的整個冠狀切片，設(shè)計四個OLIGs（Plp1、Mbp、Olig2和Cnp）探針做RNA原位雜交（圖6E&F）。結(jié)果顯示，在三月齡小鼠稠密的淀粉樣蛋白斑周圍，這4個OLIGs明顯減少?？梢酝茰y，在輕度Aβ暴露下，OLIG模塊高表達(dá)和相互連接，但在高密度Aβ積累的微環(huán)境中表達(dá)減少。因此，部分OLIG模塊的區(qū)域差異與不同的Aβ暴露有關(guān)。

圖6 | 隨Aβ積累，OLIG模塊的時空響應(yīng)

 

七、?人腦中PIG和OLIG模塊的可視化

作者使用3名AD患者和3名正常對照組死后的人腦樣本進(jìn)行實驗。AD大腦處于淀粉蛋白斑C階段和神經(jīng)元糾纏V-VI階段的疾病進(jìn)展期。研究描繪了與AD相關(guān)的額上回組織譜，總共報告了222個基因表達(dá)譜，包括45個人PIGs同源序列，OLIG模塊中42個斑塊反應(yīng)基因的同源序列，以及一系列細(xì)胞類型Marker。這些細(xì)胞Marker很好地在細(xì)胞分辨率下描繪了大腦區(qū)域（圖7A）。PIG模塊（圖7B,紫色）和OLIG模塊（圖7C,紅色）基因如預(yù)期的在大腦灰質(zhì)和白質(zhì)中富集。

作者使用分析小鼠ISS數(shù)據(jù)的方法來研究對照組中人PIGs和AD大腦同源序列的分布。大部分PIGs在AD和對照組中相同的細(xì)胞類型中表達(dá)。在對照組中，PIG模塊中3個子模通過星形膠質(zhì)細(xì)胞（綠色簇）和小膠質(zhì)細(xì)胞(藍(lán)色和橙色簇)表達(dá)（圖7D）。然而，作者依然在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了9個富集的PIGs(LGMN、HEXB、HEXA、CTSB、CTSA、GNS、GPX4、CTSD和ITM2B)，兩個在少突膠質(zhì)細(xì)胞中富集（LGALS3BP和CD9）。PLEK、CYBA和LAPTM5在小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞中顯著富集，而在人類的小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著富集。作者最終確定18/45的個PIGs在淀粉斑細(xì)胞位上明顯富集，包括9個小膠質(zhì)細(xì)胞PIGs，5個星形膠質(zhì)細(xì)胞PIGs以及5個多細(xì)胞類型表達(dá)的PIGs。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)APOE和ARPC1B在小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著表達(dá)，NPC2、 S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR在AD患者星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著表達(dá)，而在對照組中沒有，提示在AD患者中疾病相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞激活。

作者使用類似的方法，從OLIG模塊中差異表達(dá)*高的基因選出42個人類同源序列的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞特征分析（圖7E）。淀粉樣斑塊細(xì)胞生態(tài)位中有22個基因顯著缺失，5個基因在淀粉樣斑塊細(xì)胞生態(tài)位中顯著增高表達(dá)。有趣的是,通常由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的APOD在大腦中表達(dá)，并在AD中上調(diào)，在AD患者的小膠質(zhì)細(xì)胞中也顯著富集，但在對照組中沒有。

對比人和小鼠的數(shù)據(jù)，需要顧及物種差異，在鼠中，只有淀粉樣斑塊誘導(dǎo)的病理進(jìn)行了研究，然而，AD的后期階段，Tau蛋白、壞死性凋亡等等對病理的額外貢獻(xiàn)導(dǎo)致病理情況變得復(fù)雜，并沒有出現(xiàn)在小鼠模型中。小鼠模型反映了疾病的早期階段，而人從淀粉斑出現(xiàn)到最終發(fā)展為癡呆需要長達(dá)20年的時間。人類疾病發(fā)生的過程會更加復(fù)雜，不過小鼠中鑒定出的PIG和OLIG模塊會在AD晚期有重要作用。

圖7 | 通過ISS使人腦中PIG和OLIG模塊可視化

 

文章總結(jié)

本文使用空間轉(zhuǎn)錄組在數(shù)百個微小組織區(qū)域（TDs）進(jìn)行原位測序，發(fā)現(xiàn)了淀粉樣蛋白斑誘導(dǎo)的全基因組轉(zhuǎn)錄組改變。同時使用正交的原位測序方法在單細(xì)胞水平分析了數(shù)百個重要基因。進(jìn)而繪制了響應(yīng)Aβ沉積的兩個基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)—-PIGs和OLIG。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白斑并不是簡單的“發(fā)病結(jié)果”，還會誘導(dǎo)一系列的基因變化 ，影響疾病進(jìn)展。