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ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)搭上代謝組帶你玩出不一樣的高度，且看全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組如何推陳出新。百邁客合作單位于2021年4月9日在J Agric Food Chem雜志上發(fā)表關(guān)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組在Zucker糖尿病的應(yīng)用，下面一起來(lái)欣賞該文詳細(xì)解析。

英文題目：¹H NMR Metabolomics and Full-Length RNA-Seq Reveal Effects of
Acylated and Nonacylated Anthocyanins on Hepatic Metabolites and Gene Expression in Zucker Diabetic Fatty Rats
發(fā)表雜志：J Agric Food Chem
影響因子：4.192
發(fā)表時(shí)間：2021年4月9日
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.1c00130

摘要

花色苷是植物中的一大類多酚化合物，目前已知是對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥和能量穩(wěn)態(tài)有調(diào)節(jié)作用。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)花色苷具有抗糖尿病的療效?；ㄉ盏暮诵慕Y(jié)構(gòu)是花青苷，它可以糖基化形成非?；幕ㄇ嘬?，糖苷可以?；笮纬甚；幕ㄇ嘬?。且最近有研究表明，與未酰化的花青苷相比，?；ㄇ嘬站哂懈玫姆€(wěn)定性和抗氧化活性。本研究利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和核磁共振代謝組學(xué)方法，比較了非?；王；ㄉ諏?duì)糖尿病大鼠肝臟基因表達(dá)和代謝的影響。這是第一次綜合應(yīng)用這兩種強(qiáng)大的技術(shù)來(lái)研究肝臟基因表達(dá)和代謝產(chǎn)物的變化。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以喂養(yǎng)高脂飼料的雄性ZDF大鼠(fa/fa)作為2型糖尿病模型，瘦型且健康的 Zucker大鼠(fa/+)作為健康對(duì)照。干預(yù)8周后，禁食12h，異氟醚麻醉下處死。測(cè)量肝臟、附睪脂肪質(zhì)量及其占體重的百分比。肝臟立即在液氮中冷凍，并儲(chǔ)存在?80°C下。

注：NAAB：藍(lán)莓非?；ㄉ仗崛∥铮籄APP：紫色馬鈴薯?；ㄉ仗崛∥?/h5>

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

用代謝組學(xué)方法檢測(cè)NAAB和AAPP對(duì)ZDF大鼠肝臟代謝產(chǎn)物的影響，并用ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組方法研究其基因表達(dá)的變化。（ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由百邁客協(xié)助完成）
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

測(cè)序平臺(tái)

Nanopore ，¹H NMR

文章結(jié)果

1、肝臟、附睪脂肪重量及不同組別DETs、DEGs的統(tǒng)計(jì)分析

表1中可見(jiàn)，M組的肝臟和附睪脂肪重量及其占體重的百分比顯著高于CON組和ND組(p<0.05)。CON組的大鼠肝臟重量和肝/體比明顯高于ND組(P<0.05)。H-AAPP組大鼠肝/體重比明顯低于M組(p<0.05)。
對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在6個(gè)不同組之間的差異分析結(jié)果中，健康對(duì)照組和糖尿病模型之間有691個(gè)上調(diào)和1098個(gè)下調(diào)的DEGs，2469個(gè)上調(diào)和2483個(gè)下調(diào)的DETs (圖1A和B)。與M組相比，H-AAPP處理改變了最多的基因和轉(zhuǎn)錄本(101個(gè)上調(diào)和179個(gè)下調(diào)的DEGs，89個(gè)上調(diào)和780個(gè)下調(diào)的DETs)。DEGs和DETs的熱圖顯示，ND組和CON組在基因表達(dá)模式上與M組有很大不同，而且H-AAPP組的轉(zhuǎn)錄組圖譜似乎比M組更接近ND組和CON組(圖1C和D)。
高水平的肝臟重量和肝臟重量/體重比提示脂肪肝的發(fā)展。H-AAPP降低了這些水平，表明脂肪肝的狀態(tài)可能有所改善。與M組相比，H-AAPP組表現(xiàn)出最多的DEG和DET數(shù)，并且在轉(zhuǎn)錄水平上與CON和ND組屬于同一簇。因此，H-AAPP對(duì)ZDF大鼠可能起到最有益的作用。

表1.藍(lán)莓和紫色馬鈴薯花色苷對(duì)喂飼不同實(shí)驗(yàn)飲食的瘦型Zucker大鼠(fa/+)和肥胖型Zucker大鼠(fa/fa)體重、肝臟質(zhì)量、附睪脂肪及其占體重百分比的影響

 

圖1 DEGs(AC)及DETs(BD)的統(tǒng)計(jì)分析

2、ZDF大鼠中花色苷提取物對(duì)基因的修復(fù)作用

韋恩圖表明了不同分組之間上調(diào)和下調(diào)的DEG的交集，揭示了受NAAB和AAPP影響的特定基因(圖2A?D)。Gstm6與谷胱甘肽代謝、藥物代謝以及細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝有關(guān)，在胰島素抵抗和糖尿病小鼠中均被報(bào)道下調(diào)，并可能參與T2D的進(jìn)展。L-NAAB和H-NAAB均能恢復(fù)Gstm6的表達(dá)。與ND組和Con組相比，M組中有一個(gè)共同的基因被兩種花色苷提取物(NAAB和AAPP)上調(diào)，即編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶GnT-4a的Mgat4a。在小鼠中，Mgat4a基因的遺傳失活導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2N-聚糖的錯(cuò)誤組裝，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2和質(zhì)膜凝集素Galectin 9之間的相互作用失敗，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2內(nèi)化，從而抑制葡萄糖攝取和葡萄糖刺激的胰島素分泌。還發(fā)現(xiàn)高脂飲食抑制了Mgat4a的表達(dá)。藍(lán)莓的非酰化花色苷和紫色馬鈴薯的酰化花青苷都是如此。編碼脂蛋白脂肪酶的LPL在小鼠肝臟中過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致肝臟甘油三酯含量增加2倍，并導(dǎo)致胰島素抵抗，部分原因是對(duì)胰島素的反應(yīng)受損，抑制內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生。在本研究中，L-NAAB和H-NAAB都下調(diào)了ZDF大鼠高水平的LPL，這可能導(dǎo)致胰島素敏感性的改善。早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(Egr1)可被胰高血糖素短暫激活，介導(dǎo)胰高血糖素調(diào)節(jié)的糖異生。AAPP降低Egr1，這可能與糖異生減少有關(guān)。

圖2.不同分組差異基因韋恩圖

3、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖

基于差異分組的DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以揭示具有高度連接性的關(guān)鍵基因(圖3A?F)。
在CON/M比較中，發(fā)現(xiàn)FASN、Acly、AcacA和Srebf1是增加的關(guān)鍵中心基因。FASN、Acly和AcacA是Srebf1編碼的甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)的靶基因。這些基因的表達(dá)是脂肪酸合成所必需的，而在M組，脂肪酸合成增加了。發(fā)現(xiàn)M組與CON組和ND組相比，有3個(gè)關(guān)鍵中心基因增加，分別是GAPDH、Src和ESR1。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的活性在糖尿病中明顯受到干擾，Src作為肝臟葡萄糖產(chǎn)生的重要協(xié)調(diào)者，可以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體(GCPRs)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和活性氧(ROS)在2型糖尿病中被激活。因此，ZDF大鼠可能具有脂肪酸合成活躍和低糖的特征。Fos和Jun是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子激活蛋白1(AP-1)的兩個(gè)亞基。AP-1的活性可以受到各種刺激的調(diào)節(jié)，包括應(yīng)激信號(hào)、細(xì)胞因子、感染和生長(zhǎng)因子。AP-1在ZDF大鼠中的表達(dá)增加是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激可以激活Jun氨基末端激酶(JNK)并進(jìn)一步正向調(diào)節(jié)AP-1，而抑制JNK可改善糖尿病小鼠的糖耐量和胰島素抵抗。在結(jié)果中，M組的Jun比ND組增加，AAPP提取物顯著下調(diào)了Jun和Fos的表達(dá)。大劑量藍(lán)莓花色苷提取物(HNAAB)也下調(diào)了Jun的表達(dá)。與NAAB提取物相比，AAPP提取物可能具有更好的調(diào)節(jié)AP-1、緩解胰島素抵抗和改善糖耐量的能力。

圖3.DEGs生成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

4、基于ClueGO分析的功能注釋網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)不同分組中的DEGs進(jìn)行ClueGO分析，以生成按功能分組的注釋網(wǎng)絡(luò)圖（圖4A?F)。在CON/M差異分組的結(jié)果中，DEGs主要富集在羧酸生物合成過(guò)程、單羧酸代謝過(guò)程和對(duì)其他有機(jī)物的反應(yīng)過(guò)程。在ND/M分組差異結(jié)果中，脂肪酸代謝過(guò)程、羧酸代謝過(guò)程和對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)過(guò)程是富集排名前3的功能分組。在ND/M和CON/M分組中，DEGs主要在單羧酸代謝過(guò)程、羧酸生物合成過(guò)程、脂肪酸代謝過(guò)程、脂肪代謝過(guò)程和對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)過(guò)程相關(guān)的通路中富集。在L-NAAB/M分組差異結(jié)果中，DEGs組要與三個(gè)功能通過(guò)有關(guān)：質(zhì)膜組織、感覺(jué)調(diào)節(jié)和細(xì)胞對(duì)脂肪酸的反應(yīng)。在H-NAAB/M差異結(jié)果中，DEGs主要富集于基因沉默的負(fù)調(diào)控、甘油三酯代謝過(guò)程的調(diào)控以及RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在L-AAPP/M比較中，DEGs在甘油三酯分解代謝過(guò)程、骨骼肌細(xì)胞分化和軸規(guī)范方面都明顯富集。在H-AAPP/M差異結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合體、細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-1的反應(yīng)以及RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合等通路顯著富集。

圖4.DEG富集的GO注釋網(wǎng)絡(luò)圖

5、KEGG通路富集分析

接下來(lái)，進(jìn)行了KEGG通路富集分析。氣泡圖展示富集最顯著的前20條通路(圖5A?F)。與M組相比，Con組上調(diào)的DEGs主要富集于以下通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，亞油酸代謝，金黃色葡萄球菌感染，補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以及甲型流感病毒。ND組與M組相比，上調(diào)的DEGs主要富集在花生四烯酸代謝、金黃色葡萄球菌感染、移植物抗宿主病、吞噬小體等通路中，而ND組與M組相比上調(diào)的DEGs主要富集在以下通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、亞油酸代謝、金黃色葡萄球菌感染、移植物抗宿主病、吞噬小體。在CON/M和ND/M比較中，下調(diào)的DEGs在相似的KEGG通路中富集：不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝、脂肪酸伸長(zhǎng)、氧化磷酸化和碳代謝。
對(duì)于花色苷處理組，L-NAAB組上調(diào)的DEGs在N-糖鏈生物合成通路中顯著富集。L-NAAB組下調(diào)的DEGs在泛酸和CoA生物合成通路中顯著富集。在H-NAAB、L-AAPP和H-AAPP組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)下調(diào)的DEGs有顯著富集的通路，在H-NAAB和L-AAPP組中上調(diào)的DEGs也沒(méi)有富集的通路。H-AAPP中上調(diào)的DEGs在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、不飽和脂肪酸和變形蟲(chóng)病的生物合成等通路中顯著富集。

圖5.不同分組中差異基因KEGG通路富集圖（部分展示）

6、利用代謝組檢測(cè)代謝物及相關(guān)基因的表達(dá)

為了從代謝物水平上研究這些花青苷提取物對(duì)糖尿病ZDF大鼠肝臟的影響，進(jìn)行了¹H NMR代謝組學(xué)研究。糖酵解代謝產(chǎn)物–肝葡萄糖、乳酸、丙氨酸和丙酮酸在M組升高。這可能反映了2型糖尿病患者糖酵解過(guò)度。此外，乳酸、甘油、丙氨酸和谷氨酰胺是主要的糖異生前體，占總糖異生的90%以上。結(jié)果表明，與對(duì)照組(CON和ND)相比，M組的糖酵解和糖異生水平升高。各花色苷處理組大鼠的血糖、乳酸、丙氨酸、丙酮酸和甘油水平均降低，而?；ㄉ?AAPP)處理組還降低了谷氨酰胺水平，表明花色苷提取物降低了肝臟葡萄糖產(chǎn)量，改善了糖酵解和糖異生代謝(圖6A)。
GCK編碼的葡萄糖激酶和PKLR編碼的肝丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中催化不可逆步驟的關(guān)鍵酶。GCK和葡糖激酶蛋白水平均降低。NAAB增加了GCK的表達(dá)，表明其作為葡糖激酶激活劑的潛在作用。AAPP顯著降低PKLR的表達(dá)，提示AAPP可能降低糖尿病大鼠的糖酵解(圖6B?C)。肝糖異生中的兩種限速酶是編碼G6PC(編碼葡萄糖6-磷酸酶催化亞基)和Pck1(編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)。L-AAPP、H-AAPP和H-NAAB顯著降低肝臟中G6pc的表達(dá)，這與先前的qPCR結(jié)果一致，H-AAPP顯著降低了Pck1的表達(dá)。H-NAAB和AAPP在基因表達(dá)水平調(diào)控糖尿病糖酵解和糖異生。
然而，ZDF大鼠中谷氨酰胺/谷氨酸比值對(duì)花青苷提取物無(wú)反應(yīng)(圖6D)，但L-AAPP和H-AAPP降低谷氨酰胺和谷氨酸，H-NAAB降低谷氨酸（圖6E)。與M相比，所有花青苷處理組的二甲基甘氨酸升高的水平都被逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)(圖6F)。與M組相比，編碼甜菜堿-同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶的BHMT均降低。在脂質(zhì)代謝產(chǎn)物方面，L-AAPP組和H-AAPP組的肝脂譜略有改善，表現(xiàn)為脂肪酸殘留量、包括ω-3脂肪酸在內(nèi)的不飽和脂肪酸和Ara+EPA的下降趨勢(shì)(圖6G?H)。M組顯示出總體脂質(zhì)譜增加，如高水平的磷脂、甘油三酯、脂肪酸和不飽和脂肪酸，所有這些都有助于脂肪肝的發(fā)展。L-AAPP和H-AAPP組通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸殘基和不飽和脂肪酸略有改善肝脂代謝。

圖6 NAAB和AAPP處理對(duì)ZDF大鼠肝臟代謝產(chǎn)物的影響

7、WGCNA分析

使用DEGs進(jìn)行WGCNA分析以確定共表達(dá)模塊及其與臨床特征的相關(guān)性。確定了12個(gè)共表達(dá)模塊，并與以前報(bào)道的各種臨床特征(體重、AST、ALT、血尿素氮、血糖和胰島素)相關(guān)(圖7A)。MEgery 60和MEtan模塊與體重、肝重/體重比、血糖、肝糖呈正相關(guān)，與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶呈負(fù)相關(guān)。MEgreen和MEgreenyellow模塊與體重、肝重/體重比、血糖、肝糖呈負(fù)相關(guān)，與AST值呈正相關(guān)。
接下來(lái)，對(duì)MEgrey60和MEtan模塊以及MEgreen和MEgreenyellow模塊中的基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEgrey60和MEtan中的基因富集的通路主要涉及脂類代謝(脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié))、氨基酸代謝(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝)、糖尿病(青少年成熟期糖尿病、II型糖尿病、I型糖尿病、胰島素信號(hào)通路)(圖7B)。MEgreen和MEgreenyellow模塊中的基因主要富集在花生四烯酸代謝、視黃醇代謝、代謝途徑、蛋白質(zhì)輸出、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、類固醇激素生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、亞油酸代謝以及TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)(圖7C)。

圖7相關(guān)性熱圖及KEGG通路富集分析

總結(jié)

綜上所述，本研究首次對(duì)紫色馬鈴薯?；ㄉ蘸退{(lán)莓非酰化花色苷對(duì)ZDF大鼠肝臟代謝的影響進(jìn)行了多組學(xué)分析。在所有花色苷處理組中，高劑量馬鈴薯花色苷(H-AAPP)處理組的轉(zhuǎn)錄和代謝特征更接近瘦型Zucker大鼠。發(fā)現(xiàn)兩種花色苷提取物，尤其是AAPP，都通過(guò)恢復(fù)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)和代謝產(chǎn)物，在基因表達(dá)水平上降低AP-1的表達(dá)，從而起到有益的作用。

總體而言，本文的研究表明，紫色馬鈴薯中的?；ㄉ帐且环N廉價(jià)的花色苷來(lái)源，與藍(lán)莓中的非?；ㄉ障啾龋仙R鈴薯中提取的酰化花色苷對(duì)肝臟轉(zhuǎn)錄和代謝譜有更好的調(diào)節(jié)作用。
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33835816
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