研究背景

肝臟由超過(guò)20種細(xì)胞類型組成，包括肝細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞、間皮細(xì)胞、ER細(xì)胞和各種循環(huán)免疫細(xì)胞。在人類胎兒的發(fā)育過(guò)程中，肝臟是重要的造血器官。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPC）在大約6周時(shí)在人體內(nèi)遷移到肝芽中。然后，胎兒肝臟成為主要的造血器官，并為HSPC增殖和分化提供了特定的生態(tài)位。肝臟是人體的重要器官之一，易受體內(nèi)外多種致病因素的影響，引起炎癥和損傷。肝臟疾病是導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的主要因素。此外，肝臟有很強(qiáng)的再生能力。肝部分切除術(shù)后，肝臟的再生依賴于殘余肝組織的再生能力。因此，對(duì)胎兒肝臟發(fā)育的研究對(duì)于我們了解肝臟發(fā)育和再生機(jī)制也至關(guān)重要。

結(jié)論

本文中作者結(jié)合了單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人類從受孕后8周（PCW）到17周（PCW）的胎兒肝臟進(jìn)行了分析。系統(tǒng)地鑒定了9種細(xì)胞類型，并確定了主要細(xì)胞類型的發(fā)育途徑。結(jié)果表明，人胎肝在實(shí)驗(yàn)期間經(jīng)歷了血液的快速生長(zhǎng)和遷移，并鑒定了紅系細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因和代謝變化。此外，作者還對(duì)肝病相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)17個(gè)已發(fā)表并與肝病相關(guān)的基因主要在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞類型中幾乎不表達(dá)?？傊?，作者的研究結(jié)果提供了一個(gè)全面而清晰的了解人類胚胎肝臟中所有主要細(xì)胞類型的分化過(guò)程，這可能為肝臟疾病的治療和肝臟再生提供參考數(shù)據(jù)和信息。

 

中文題目：整合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示了人類胚胎肝臟的基因表達(dá)譜

英文題目：Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver.

期刊：Front Cell Dev Biol

發(fā)表時(shí)間：2021.5

作者：Xianliang Hou

材料與方法

材料：受孕后8周和17周人類發(fā)育中的肝組織；

方法：10× Genomics Visium Spatial Gene Expression Slides。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、細(xì)胞聚類與類型鑒定

為了研究胎兒肝臟中免疫細(xì)胞和紅細(xì)胞的發(fā)育，作者利用ST技術(shù)分析了人類肝臟發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)。在篩選數(shù)據(jù)后，在8周PCW肝臟中檢測(cè)到1267個(gè)高質(zhì)量spots，平均每個(gè)spot包含204,628條reads，檢測(cè)到1,132個(gè)基因和5,924個(gè)UMIs。在17周PCW中，肝臟由3,489個(gè)單獨(dú)spots組成，平均78,576條reads，8,829個(gè)UMI，過(guò)濾后每個(gè)點(diǎn)檢測(cè)到2,266個(gè)基因。通過(guò)對(duì)每個(gè)ST陣列的spots進(jìn)行降維和聚類，根據(jù)基因表達(dá)模式在8周PCW肝臟（圖1A）和17周PCW肝臟（圖1B）中確定了6個(gè)和10個(gè)主要cluster。由于ST缺乏細(xì)胞分辨率，作者利用scRNA-seq技術(shù)研究了8周PCW和17周PCW活組織的基因表達(dá)異質(zhì)性。在應(yīng)用質(zhì)量控制過(guò)濾器和標(biāo)準(zhǔn)化后，scRNA序列數(shù)據(jù)分別25,186個(gè)細(xì)胞和9,153個(gè)細(xì)胞組成，每個(gè)細(xì)胞中有2,454和2,705個(gè)獨(dú)特表達(dá)的基因。為了探索活體器官的細(xì)胞組成，作者處理了單細(xì)胞數(shù)據(jù)，并在8和17周PCW肝臟中鑒定了31和25種細(xì)胞狀態(tài)，每種狀態(tài)都根據(jù)文獻(xiàn)中已知的標(biāo)記基因進(jìn)行了注釋（圖1C-F）。作者將這些cluster鑒定為B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、DC1、DC2、早期成紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、HSC_MPP、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、kuper、ILC、晚期成紅細(xì)胞、MEMP、肥大細(xì)胞、巨核細(xì)胞、中成紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK、pDC、Pre、Pre-B、Pro-B和VCAM1+。

圖1

二、Multimodal交互式分析

為了整合scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)集，作者應(yīng)用了先前報(bào)道的Multimodal Intersection Analysis(MIA)進(jìn)行分析。通過(guò)MIA方法發(fā)現(xiàn)在跨空間區(qū)域識(shí)別細(xì)胞類型的消耗和富集方面是穩(wěn)健的（圖2A，B）。例如，作者發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞、kuper細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞的高表達(dá)基因在ST和scRNA序列數(shù)據(jù)之間顯著重疊（圖2C）。8周 PCW肝臟由kuper、中成紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、晚期成紅細(xì)胞、早期成紅細(xì)胞組成（圖2D）。17 周PCW肝臟由肝細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、早期成紅細(xì)胞、中期成紅細(xì)胞、晚期成紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞組成（圖2E）?；谄骄鶎?duì)數(shù)變化，每個(gè)cluster的前10個(gè)基因的熱圖顯示了cluster之間的高度異質(zhì)性（圖3A，B）。此外，作者在每種細(xì)胞類型中選擇一個(gè)最明顯的特征基因，并以點(diǎn)圖的形式呈現(xiàn)以比較差異（圖3C）。根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性，用單核細(xì)胞按預(yù)測(cè)的發(fā)育軌跡（擬時(shí)序）組織細(xì)胞。它產(chǎn)生了一個(gè)緊密相連的分化軌跡，分為兩個(gè)主要分支，分別對(duì)應(yīng)于不同時(shí)期的8和17 PCW（圖3D）

圖2

圖3

三、人胎肝細(xì)胞的空間分辨異質(zhì)性

如圖3E所示，肝細(xì)胞是17 PCW肝臟的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞。作者觀察到三個(gè)不同的肝細(xì)胞cluster（cluster1、3和4）沿著17周PCW肝臟的空間深度分布（圖4A、B）。作者發(fā)現(xiàn)MEG3、ITIH3和HMGCS1呈cluster1高表達(dá)。FGB、IGFBP1和A2M基因在cluster3中表達(dá)更高，表明區(qū)域DEGs可能參與了相應(yīng)區(qū)域特異性功能的形成。此外，cluster4組中的肝細(xì)胞高表達(dá)數(shù)個(gè)基因，包括MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3，它們參與線粒體電子傳遞和氧化磷酸化。值得注意的是，cluster1和3主要聚集在肝組織的中心區(qū)域，cluster4主要聚集在肝的周圍區(qū)域（圖4a）。差異表達(dá)分析的熱圖顯示肝細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸下調(diào)或上調(diào)的基因。GO分析表明，1-3-4cluster中逐漸上調(diào)的基因主要與細(xì)胞極性通路、Wnt信號(hào)通路和GTPase活性的調(diào)節(jié)有關(guān)，而逐漸下調(diào)的基因則參與壞死細(xì)胞死亡、糖原生物合成過(guò)程的調(diào)節(jié)，肝臟再生。此外，作者描述了cluster1-3-4細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊（圖4C），為將來(lái)的研究提供了潛在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信息。值得注意的是，盡管cluster3和cluster1的距離更近，但cluster3與cluster4細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)比cluster1細(xì)胞更為顯著。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一些共享的和活躍的配體-受體對(duì)，如DLK1-NOTCH2、EFNA1EPHA2、AGT-AGTR1，這些配體-受體對(duì)既存在于cluster1細(xì)胞與cluster4細(xì)胞的細(xì)胞通訊中，也存在于cluster3細(xì)胞與cluster4細(xì)胞的細(xì)胞通訊中。

在17周PCW肝臟的scRNA序列數(shù)據(jù)中，肝細(xì)胞可進(jìn)一步細(xì)分為三個(gè)cluster。熱圖顯示了每個(gè)cluster的前十個(gè)標(biāo)記基因（圖4D）。作者檢測(cè)了LGR5的表達(dá)模式，并根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了一部分LGR5+肝母細(xì)胞（圖4E）。在8 周PCW肝臟，5.68%的肝母細(xì)胞表達(dá)LGR5，而在17周 PCW肝臟，LGR5+細(xì)胞的比例下降到3.80%。此外，在8和17 PCW肝臟存在HNF4A+ID3+肝母細(xì)胞亞群（圖4F）。作者將這些HNF4A+ID3+細(xì)胞命名為ID3+肝母細(xì)胞。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，8周PCW肝母細(xì)胞中25.26%（475個(gè)細(xì)胞中120個(gè)細(xì)胞）和17周PCW肝母細(xì)胞中15.76%（184個(gè)細(xì)胞中29個(gè)細(xì)胞）屬于這個(gè)cluster。此外，DLK1在ID3+肝母細(xì)胞中高表達(dá)，而NCAM1在ID3+肝母細(xì)胞中不表達(dá)。作者在17 PCW胎肝中鑒定出巨核細(xì)胞的兩種主要細(xì)胞狀態(tài)（cluster7和cluster10）（圖2E）。結(jié)果顯示，第7組中PF4、PPBP、ITGA2B、GP9和MYL9上調(diào)，第10組中JCHAIN、IGLC3、IGLC2、IGHM和IGKC上調(diào)。

圖4

四、人胎肝組織紅細(xì)胞分化與成熟途徑研究

在8PCW肝臟中，小的紅細(xì)胞簇散布在整個(gè)肝臟中（圖5A）。在17PCW肝臟中，肝臟充滿了紅細(xì)胞，并且完全變紅（圖5b）。值得注意的是，早期的紅細(xì)胞位于肝組織的外圍，而中期紅細(xì)胞和晚期紅細(xì)胞則分散在肝組織的中心區(qū)域（圖5B）。這一戲劇性的形態(tài)學(xué)變化表明，在實(shí)驗(yàn)研究期間，人類胎兒肝臟都經(jīng)歷了血液的快速生長(zhǎng)和遷移。在8和17PCW肝中均有早、中、晚期成紅細(xì)胞。為了研究紅細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，作者研究了這三種類型紅細(xì)胞間差異表達(dá)的基因。在8PCW肝臟中，818個(gè)基因在早、晚分化過(guò)程中逐漸下調(diào)，2648個(gè)基因在早、晚分化過(guò)程中逐漸上調(diào)。逐漸上調(diào)的基因富含乙醛酸和二羧酸代謝、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝和嘌呤代謝，而逐漸下調(diào)的基因與丁酸代謝相關(guān)（圖5C）。在17PCW肝組織中，有812個(gè)基因在分化早期、中晚期逐漸下調(diào)，880個(gè)基因在分化早期、中晚期逐漸上調(diào)。
對(duì)下調(diào)基因的KEGG富集分析顯示，最顯著的包括果糖和甘露糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、?；撬岷偷团；撬岽x、組氨酸和硫胺代謝相關(guān)的信號(hào)通路。上調(diào)基因的高度富集項(xiàng)與丙酸代謝有關(guān)（圖5D）。作者進(jìn)行了早、中、晚期細(xì)胞間的配體-受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)在早期-中晚期細(xì)胞通訊中發(fā)現(xiàn)了促紅細(xì)胞生成素（EPO）、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C（PTPRC）、連接蛋白細(xì)胞粘附分子3（NECTIN3）（圖5E）。此外，還對(duì)紅細(xì)胞的分化軌跡進(jìn)行了分析，得出了一條緊密相連的分化軌跡，分化成五個(gè)主要分支（圖5F）。這表明系統(tǒng)是通過(guò)一個(gè)連續(xù)的而不是幾個(gè)斷開(kāi)的譜系來(lái)維持的。此外，在8PCW肝臟和17PCW肝臟的早期、中期和晚期紅細(xì)胞中分別鑒定了617、674和503個(gè)DEGs。為了進(jìn)一步了解8PCW肝臟和17PCW肝臟之間紅細(xì)胞的差異，對(duì)兩個(gè)胚胎階段的基因表達(dá)模式進(jìn)行了PCA分析。從每種細(xì)胞類型中取樣50個(gè)點(diǎn)以產(chǎn)生平衡的數(shù)據(jù)集，并且發(fā)現(xiàn)基于它們的轉(zhuǎn)錄相似性可以區(qū)分8 PCW和17 PCW肝臟中的所有點(diǎn)（圖5G，H）。

圖5

五、人胎肝組織中肝病相關(guān)基因的表達(dá)模式

為了確定與肝臟疾病胎兒起源相關(guān)的功能基因，作者將胎兒肝臟ST數(shù)據(jù)與公開(kāi)的網(wǎng)絡(luò)資源整合，以直觀地探索與肝臟疾病相關(guān)的細(xì)胞類型和空間區(qū)域。17個(gè)已發(fā)表并與肝病相關(guān)的基因主要在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在任何其他細(xì)胞類型中幾乎不表達(dá)（圖6A，B）。例如，SPP1、TGFB1、JAG1、STAT1和VIM與先天性膽道閉鎖有關(guān)，并被證實(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。TGFB1和THBS1（先天性肝纖維化相關(guān)）在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有高表達(dá)。此外，兒童肝細(xì)胞癌相關(guān)基因SPP1和TGFB1在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中也有強(qiáng)表達(dá)。值得注意的是，SPP1和TGFB1基因不僅與先天性（和兒童期）肝病有關(guān)，也與成人肝病有關(guān)。在此，作者還分析了一些與成人肝病相關(guān)的基因的特異性表達(dá)。例如，乙型肝炎相關(guān)基因（GP1BA、HSPG2、CCL5和SPP1）、脂肪肝相關(guān)基因（COL3A1、CCL5和SPP1）、酒精性肝病相關(guān)基因（CAV1、ELANE、CCL5和SPP1）、原發(fā)性膽汁性肝硬化相關(guān)基因（TGFB1、PDE5A、COL1A1、CCL5和SPP1）和原發(fā)性惡性肝腫瘤相關(guān)基因（SELP、PECAM1、，HSPG2和THY1）主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞，在其他細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。

為了進(jìn)一步揭示這一現(xiàn)象，作者分析了這17種肝病相關(guān)基因在17PCW胚胎腎臟中的表達(dá)水平。除PECAM1外，其余基因在17PCW腎中表達(dá)。但其表達(dá)模式與肝臟不同，主要不在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，說(shuō)明這些肝病相關(guān)基因在胚胎肝臟中具有獨(dú)特的基因表達(dá)模式。此外，對(duì)這17個(gè)肝病相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示TGFB1、COL1A1、SPP1、PECAM1和THBS1在表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，而PDE5A與其他基因沒(méi)有相互作用（圖6C）。

圖6

六、人胎肝組織發(fā)育基因分析WGCNA分析

為了更好地了解與肝臟發(fā)育相關(guān)的基因調(diào)控變化和細(xì)胞類型之間的相互作用，作者使用WGCNA算法構(gòu)建了一個(gè)基于主要細(xì)胞簇中差異表達(dá)基因的ST數(shù)據(jù)無(wú)偏共表達(dá)分析。在8PCW肝臟中確定了5個(gè)主要的共表達(dá)模塊，并在17PCW肝臟中定義了兩個(gè)基因表達(dá)模塊（相關(guān)指數(shù)>0.56）（圖7A）。每個(gè)模塊在細(xì)胞cluster中顯示出不同的相關(guān)性。分析這些模塊發(fā)現(xiàn)，許多模塊是由基因優(yōu)先表達(dá)在特定的細(xì)胞群。此外，高相關(guān)性模塊往往包含豐富的KEGG途徑、GO生物過(guò)程和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，這進(jìn)一步突出了基因功能的協(xié)作模式（圖7B）。在8 PCW肝臟中，KEGG分析顯示藍(lán)色模塊富集了多種途徑，包括核糖體、DNA復(fù)制和谷胱甘肽代謝。黃色模塊23個(gè)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示了PF4和PPBP在表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的重要作用。此外，細(xì)胞群之間的細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控是胎兒肝臟發(fā)育的過(guò)程。為了研究胎兒肝臟中的細(xì)胞通訊和空間串?dāng)_，作者進(jìn)行了配體-受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞cluster之間存在活躍的細(xì)胞通訊（圖7C、D）。CD74-MIF、DLK1-NOTCH3、IGF2-IGF1R、AGT-AGTR1和CCL2-ACKR1等配體-受體對(duì)在8PCW肝臟中更常見(jiàn)，ESAM-ESAM、TIMP1-FGFR2、JAG1-NOTCH3、LTBR-LTB和PLXNB2-PTN等配體-受體對(duì)在17PCW肝臟中更常見(jiàn)。此外，8PCW和17PCW肝臟共有129個(gè)配體-受體對(duì)。

圖7

討論

人類胎兒肝臟在子宮內(nèi)的發(fā)育至今仍知之甚少。在這項(xiàng)研究中，作者應(yīng)用了一種方法來(lái)識(shí)別和空間定位胎兒肝組織中不同的細(xì)胞狀態(tài)、亞群和細(xì)胞類型。該方法首先通過(guò)scRNA-seq對(duì)活組織中存在的cluster和細(xì)胞類型進(jìn)行表征，同時(shí)通過(guò)ST鑒定轉(zhuǎn)錄組區(qū)域。通過(guò)MIA，可以完美地整合ST數(shù)據(jù)和scRNA-seq數(shù)據(jù)，并以無(wú)偏的方式分析感興趣區(qū)域的數(shù)據(jù)。
在ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定了三個(gè)肝細(xì)胞亞群，它們?cè)诿總€(gè)亞群中顯示出不同的基因表達(dá)和功能富集。提示不同區(qū)域的肝細(xì)胞可能具有不同的功能。在這些亞群的細(xì)胞通訊中，發(fā)現(xiàn)了幾種活性配體-受體對(duì)，如DLK1NOTCH2、EFNA1-EPHA2、AGT-AGTR1。

自從Barker（1990）發(fā)表了《成人疾病的胎兒和嬰兒起源》以來(lái)，人們對(duì)宮內(nèi)環(huán)境及其對(duì)成人疾病的影響給予了極大的重視。環(huán)境的變化會(huì)引起身體的反應(yīng)和調(diào)整。在胚胎階段，所有組織器官都處于發(fā)生、分化和發(fā)育的最敏感階段。如果宮內(nèi)環(huán)境不利于胚胎分化和發(fā)育，那么胚胎會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能變化，包括表觀遺傳機(jī)制，這種胚胎的適應(yīng)性變化將對(duì)其生命造成嚴(yán)重甚至不可逆轉(zhuǎn)的損害。在本研究中，作者重點(diǎn)研究了肝臟疾病相關(guān)基因在胚胎肝臟中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)17個(gè)已發(fā)表并與肝臟疾病相關(guān)的基因主要在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。

綜上所述，將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間信息相結(jié)合，識(shí)別出一套全面的基因探針，這些探針可以總結(jié)空間和細(xì)胞信息，并提供對(duì)人類胎兒肝臟中所有細(xì)胞類型分化過(guò)程的清晰而全面的了解。本研究所得的結(jié)果有助于今后的研究免疫性和感染性肝病發(fā)病機(jī)制的研究及治療靶點(diǎn)的確定。

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