ATAC-seq即染色質(zhì)開放性檢測,是基于高通量測序手段研究染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可接近性的一種技術，可以獲得全基因度尺度上處于開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，從而分析潛在的活躍轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因，目前已廣泛應用于病理生理調(diào)控機制、藥物靶點發(fā)現(xiàn)、耐藥機制探究等方向，與轉(zhuǎn)錄組結合可構建轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡；ONT全長轉(zhuǎn)錄組是利用ONT長讀長測序平臺，無需打斷，完整測到轉(zhuǎn)錄本全長序列，相比于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組，可在準確分析轉(zhuǎn)錄本水平的表達量的同時，對序列結構進行準確解析，得到可變剪切、可變多聚腺苷酸、融合基因等分析結果。

四川省人民醫(yī)院龔波研究員在Journal of Genetics and Genomics雜志發(fā)表題為“ Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma ” 的研究論文，結合ATAC-seq與ONT全長轉(zhuǎn)錄組，揭示FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的致癌作用等。

中文標題：全長轉(zhuǎn)錄組及ATAC協(xié)助解析神經(jīng)膠質(zhì)瘤致癌基因FAM20C調(diào)控

英文標題：Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma

期刊名稱：Journal of Genetics and Genomics

合作單位：四川省人民醫(yī)院

研究對象：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁組織

測序技術：ONT全長轉(zhuǎn)錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

百邁客為該研究提供了全長轉(zhuǎn)錄組及ATAC等測序技術服務。

研究背景

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，攻擊力極強，約占所有腦腫瘤的80%，目前主要的癌癥治療方案，包括手術切除、放療和化療，都會導致預后不良和高死亡率，很難對膠質(zhì)瘤提供理想的治療效果，因此現(xiàn)在迫切需要探索新的有效策略以及膠質(zhì)瘤治療的潛在治療靶點。長讀長RNA測序技術已應用在包括肝細胞癌和非小細胞肺癌等多種癌癥類型中，ATAC-seq也已經(jīng)應用于胰腺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤研究中。FAM20C是一種可調(diào)節(jié)分泌途徑中的各種網(wǎng)絡的分泌蛋白，主要負責礦化激酶，然而越來越多的研究表明，FAM20C?與包括包括乳腺癌、膀胱癌和結直腸癌在內(nèi)的多種癌癥廣泛相關。

材料方法

材料：神經(jīng)膠質(zhì)瘤及配套癌旁（病灶旁2cm處）組織樣本

方法：ONT全長轉(zhuǎn)錄組+ATAC-seq+qPCR+免疫組化等

研究結果

用三對膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為發(fā)現(xiàn)組進行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序，之后又用另外6對膠質(zhì)瘤及癌旁組織作為鑒定組進行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序，兩次測序中發(fā)現(xiàn)共有差異基因（DEG）503 個，在癌癥相關通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Ras信號通路中顯著富集。另外，差異基因也在神經(jīng)元活動通路中富集，表明神經(jīng)元激活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關，這與最近的研究一致，已經(jīng)有研究證明，突觸粘附分子神經(jīng)粘附蛋白-3（NLGN3）的活性依賴性裂解和分泌介導了腦癌神經(jīng)調(diào)控，有助于通過PI3K-mTOR途徑促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖，而PIK3CA 變體已被證明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中選擇性地啟動大腦過度活躍，并在神經(jīng)元環(huán)境的腫瘤重塑中增加活性發(fā)揮重要作用。因此，鑒定出的神經(jīng)元活動相關DEGs為神經(jīng)元和膠質(zhì)瘤細胞之間串擾的前瞻性研究奠定了基礎。

APA分析結果顯示，在發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集以及鑒定數(shù)據(jù)集中，共鑒定到了12492個APA事件，兩組各自有97例和260例APA事件顯示出顯著差異，且各有52例和65例APA在兩組中顯示存在多A位點，為了分析APA事件與差異表達基因的關系，結果中比較了差異APA及差異基因集合，發(fā)現(xiàn)大部分共有基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中APA 信號和表達都呈現(xiàn)較低水平，這意味著更多的多聚腺苷酸化可能有助于 mRNA 的穩(wěn)定性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的APA事件與基因表達高度相關，表明APA事件在這些基因的失調(diào)和膠質(zhì)瘤發(fā)病機制中起著關鍵作用。

為了探究神經(jīng)膠質(zhì)瘤中基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的6個樣本進行了ATAC測序，鑒定出與1129個基因關聯(lián)的1176個差異峰（DPs），如預期所料，大多數(shù)DPs分布在基因結構的近端啟動子區(qū)域，結果中觀察到兩個增加的Glypican 1（GPC1）DPs信號，其中一個位于啟動子中，另一個位于第一個內(nèi)含子區(qū)域。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中還觀察到蛋白酪氨酸磷酸酶受體 B 型 （PTPRB） 的 DP 信號降低（內(nèi)含子區(qū)），隨后將1129個DPs相關基因和503個常見DEGs進行比較，找到交集的22個基因，結合CGGA數(shù)據(jù)庫分析對應表達，發(fā)現(xiàn)有16個基因顯著差異表達，針對這16個基因的患者生存率分析發(fā)現(xiàn)，僅?RAB3A?和?FAM20C?同時具有預后及臨床的意義，另外這22個基因中，NPTN基因也是目前研究熱度較高的基因。通過qRT-PCR和免疫組化（IHC）染色驗證了NPTN和FAM20C在我們收集的神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達，在膠質(zhì)瘤較高階段的樣品中觀察到NPTN的表達顯著降低，相反，FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中的表達顯著增加，特別是在IV期，IHC 染色進一步驗證了?NPTN?通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展到晚期來抵消?FAM20C?的致癌功能。

最后，為了探索與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中?FAM20C?和?NPTN?失調(diào)相關的轉(zhuǎn)錄因子，從在線數(shù)據(jù)庫 ChIP-Atlas 下載組蛋白標記物（H3K4me 和 H3K27ac）的 ChIP 數(shù)據(jù)，并用TCGA數(shù)據(jù)集驗證這些轉(zhuǎn)錄因子在FAM20C或NPTN中的表達，最終結果表明，在TCGA數(shù)據(jù)集中，REST與FAM20C的相關系數(shù)最高。鑒定出兩個反式活性因子（BRD4 和 REST）與?FAM20C?和?NPTN?均呈正相關。結合染色質(zhì)可及性、TFs 結合位點和 APA 分析共同影響基因表達，結果表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中NPTN的表達顯著降低，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中觀察到的峰值信號增加。此外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN的APA數(shù)量明顯小于對照組。因此，提出了APA編號在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NPTN基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占主導地位的假設，本研究開創(chuàng)了FAM20C在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床意義、體外功能和樞紐轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，F(xiàn)AM20C 抗體顯著消除了?FAM20C?異位表達引起的腫瘤大小增加，總之，本項研究證明了轉(zhuǎn)錄激活的?FAM20C?是一種致癌基因，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有治療意義。

 

參考文獻：

Gong B, Liang Y, Zhang Q, Li H, Xiao J, Wang L, Chen H, Yang W, Wang X, Wang Y, He Z. Epigenetic and transcriptional activation of the secretory kinase?FAM20C?as an oncogene in glioma.?J Genet Genomics. 2023 Jun;50(6):422-433. doi:10.1016/j.jgg.2023.01.008. Epub 2023 Jan 25.