1 項目概況

1.1合同分析內(nèi)容

(1) 測序得到不低于50倍覆蓋度的數(shù)據(jù)量。

(2) 樣本質(zhì)量評估：

????a)外源物種污染率評估；

????b)線粒體含量評估；

(3) 基因組評估：

????a) 基因組大小評估；

????b) 雜合率評估；

????c) 重復(fù)序列比例評估；

????d) GC含量評估。

1.2 分析結(jié)果概述

(1) 測序獲得xx ?Gb數(shù)據(jù)，總測序深度約為xx ×，Q20比例達到xx %以上，Q30比例達到xx %以上。

(2) 通過與NT庫比對表明樣品不存在污染。

(3) 對物種的線粒體評估，發(fā)現(xiàn)線粒體含量很低。

(4) 估計基因組的大小約xx Mb，雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %。

(5) 估計基因組的GC含量約xx %。

1.3 項目分析總結(jié)

????????分析表明，樣品不存在外源物種污染，且質(zhì)體含量低，能用于構(gòu)建精細圖；同時，估計基因組大小約xx? Mb，基因組的雜合率約xx %，重復(fù)序列含量約xx %，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。推薦的測序方案為xx? ×的270 bp文庫數(shù)據(jù)和xx? ×的20 Kb三代測序文庫數(shù)據(jù)。見表1。

2 項目流程

2.1 實驗流程

????????實驗流程按照Illumina公司提供的標準protocol執(zhí)行，包括：DNA文庫制備實驗和測序?qū)嶒?。實驗流程見圖1

圖1 實驗流程圖

????????提取基因組DNA ,進行小片段文庫建庫測序。分為以下四個步驟：

（1）文庫構(gòu)建：物理破碎法（超聲波震蕩）將合格的基因組DNA破碎至目的片段（270 bp），然后經(jīng)過末端修復(fù)、加A、加接頭、目標片段選擇和PCR等步驟構(gòu)建小片段測序文庫文庫；

（2）文庫質(zhì)檢：利用2100和Q-PCR檢測文庫片段大小和文庫定量，確定文庫是否符合測序標準 ;

（3）芯片固定：通過橋式PCR將文庫固定到測序芯片上；

（4）上機測序利用Hiseq測序儀對文庫進行雙端150 bp（PE 150）測序，測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后用于下一步信息分析。

2.2 信息分析流程

雙端測序數(shù)據(jù)通過評估雙端測序數(shù)據(jù)通過評估（GC分布統(tǒng)計、質(zhì)量值Q20、Q30評估）、過濾后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean reads)，用于基因組大小的評估、基因組的組裝、GC含量的統(tǒng)計、雜合率的統(tǒng)計(以及組裝后的評估)。具體信息分析流程見圖2。

圖2 基因組調(diào)研圖信息分析流程

3 分析結(jié)果

3.1 測序結(jié)果統(tǒng)計

????????使用醫(yī)蛭樣品的基因組DNA構(gòu)建270 bp文庫，在 Illumina Hiseq測序平臺測序并過濾得到12.43 Gb高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，總測序深度約為76 ×，測序數(shù)據(jù)Q20比例均在95.34%以上，Q30比例均在89.23%以上，滿足合同要求的50 ×以上的測序數(shù)據(jù)量。文庫高質(zhì)量的數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計信息見表2。

表2 ??樣品測序結(jié)果統(tǒng)計表

3.2 樣本質(zhì)量評估

3.2.1 樣品污染評估

????????樣品如果存在污染不僅會降低有效數(shù)據(jù)量，同時還會影響調(diào)研圖分析結(jié)果的準確性，導(dǎo)致基因組大小、雜合率、重復(fù)序列比例和GC含量等基因組特征評估結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，使得基因組組裝建庫策略出現(xiàn)偏差，最終影響后續(xù)的基因組組裝效果。為了判斷提取的樣品DNA是否受到污染，我們從測序得到的270 bp文庫中，隨機取10,000條單端reads，與NT庫進行BLAST^[1]比對，270 bp文庫能夠比對上NT庫的reads分別占總reads數(shù)的1.71%，其中比對到xx 和xx上的reads數(shù)分別占比對上NT庫reads數(shù)的34.5%和6.43%，這兩個物種皆為醫(yī)蛭的近緣物種，且比對結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)植物等異常比對，因此該樣品測序數(shù)據(jù)不存在污染，可用于基因組調(diào)研圖分析。一般的評估標準：如果有一定比例的reads比對上進化距離較遠的物種如植物，微生物等，則判斷樣品可能存在污染，需要進一步檢查原因。具體比對統(tǒng)計表見表3。

表3 ??270 bp文庫NT庫比對詳表

3.2.2 線粒體含量評估

????????由于線粒體中存在核酸序列，如果物種測序文庫中線粒體DNA含量過高時，會影響后期基因組組裝。因此評估文庫中線粒體DNA含量對判斷數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)基因組組裝非常必要。為了評估測序數(shù)據(jù)中線粒體的含量，我們利用Illumina Hiseq測序得到的270 bp文庫與醫(yī)蛭近緣物種的線粒體序列（42,362 bp）進行SOAP^[2]比對。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙端比上的reads數(shù)為166，占總reads的0.00%，單端比上的reads數(shù)為13，占總reads的0.00%，這兩個的比例都低于經(jīng)驗值5%。由此判斷270 bp文庫測序數(shù)據(jù)的質(zhì)體含量很低，不影響后期基因組的組裝。比對統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表4-1 ??270 bp文庫SOAP比對結(jié)果統(tǒng)計表

3.3 基因組特征評估

????????利用基因組調(diào)研圖進行基因組特征的評估，分為四個方面：

1) 評估基因組大小;

2) 評估重復(fù)序列比例；

3) 評估雜合情況；

4) GC含量情況。

3.3.1 基因組大小、重復(fù)序列比例和雜合率評估

????????利用270 bp文庫數(shù)據(jù)構(gòu)建k=19的kmer分布圖（見圖3），進行基因組大小、重復(fù)序列比率和雜合率的評估。由圖3知，平均kmer深度即主峰對應(yīng)的kmer深度為62。kmer深度出現(xiàn)在主峰對應(yīng)深度2倍以上的序列為重復(fù)序列，即深度大于125的kmer序列為重復(fù)序列。kmer深度出現(xiàn)在主峰對應(yīng)深度一半處的序列為雜合序列，即深度出現(xiàn)在31附近的kmer序列為雜合序列。根據(jù)kmer深度信息，總kmer數(shù)目/平均kmer深度即為基因組大小，估計基因組大小約162.99 Mbp。依據(jù)kmer分布情況，估計重復(fù)序列含量約16.23%，評估出的雜合率約為1.79%，因此該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。

圖3 Kmer分布圖

3.3.2 評估GC含量

????????基因組GC含量對二代基因組測序的隨機性有較大影響。過高(>65%)或過低(<25%)的GC含量會導(dǎo)致測序偏向性，嚴重影響基因組分析結(jié)果。物種GC含量是評估調(diào)研圖分析準確性和后續(xù)基因組組裝難度的重要指標之一。通過對調(diào)研圖文庫測序數(shù)據(jù)分析，該物種基因組的GC含量約38.03%，較為適中，不會影響調(diào)研圖分析的準確性。見表5。

表5 ??基因組GC含量評估

????????綜上所述，該基因組大小約為162.99 Mb，重復(fù)序列比例約16.23%，雜合率約1.79%，基因組的GC含量約38.03%，從基因組基本結(jié)構(gòu)特征上看，該物種基因組屬于高雜合的復(fù)雜基因組。