研究背景

NATs（Natural Antisense Transcripts，天然反義轉(zhuǎn)錄本），已報道可以順式調(diào)控正義鏈基因的表達水平，增強或抑制局部水平的轉(zhuǎn)錄，或調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，招募mRNA活化多核糖體翻譯，也可以遠距離反式調(diào)節(jié)其他基因的表達。

許多l(xiāng)ncRNA作用被陸續(xù)報道，尤其是在癌癥進展方面。例如反義轉(zhuǎn)錄本ZEB2-AS（ zinc finger Ebox binding homeobox 2），調(diào)節(jié)正義鏈基因ZEB2的可變剪接。ZEB2-AS與ZEB mRNA的5’UTR的結(jié)合阻止了正確的剪接發(fā)生，導(dǎo)致內(nèi)含子保留。該事件增加了ZEB mRNA的翻譯效率，導(dǎo)致癌細胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移增強。在其他情況下，作為黑素瘤中的SAMMSON，lncRNA的敲低顯示出有效的抗腫瘤發(fā)生活性，表明這類ncRNA在癌癥治療中是有希望的候選藥物靶標。因此，鑒定癌癥相關(guān)的lncRNA增強了對癌癥生物學(xué)以及隨后的腫瘤診斷和治療的認知。

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌相關(guān)癌癥，約占所有腫瘤的4％。其發(fā)病率在過去三十年中增加了3倍。大多數(shù)甲狀腺腫瘤是分化形式，即乳突狀（PTC，75-80％）。PTC共有的遺傳變異，其中包括相互排斥的激活BRAF和RAS（H-，K-和NRAS）突變 – 分別占40-60％和10-15％的病例 – 和RET重排（RET / PTC癌基因）在約20％的病例（Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology）中描述。癌癥基因組圖譜（ The Cancer Genome Atlas Consortium）的大規(guī)模研究和作者的獨立分析發(fā)現(xiàn)，攜有BRAF基因（特別是_V600E）的體細胞突變或RET癌基因（RET / PTC）重排的PTC具有高度重疊表達模式，這種同質(zhì)亞組患者（定義為BRAF樣）與RAS突變或高度相似（RAS樣）的腫瘤樣本相比具有明顯不同的特征。

作者基于PTC的RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用從頭發(fā)現(xiàn)方法來定義BRAF和RAS樣特異性lncRNA的表達特征，并鑒定能夠調(diào)節(jié)和/或干擾甲狀腺腫瘤中已知癌癥驅(qū)動基因表達的新候選lncRNA。鑒定了一種新的天然反義COMET（COrrelated-to-MET）lncRNA，其在BRAF樣癌中顯著上調(diào)，并且在相同腫瘤中與MET癌基因表達顯著正相關(guān)。該lncRNA被轉(zhuǎn)錄為MET基因座的反義并具有細胞質(zhì)定位。COMET特異性siRNA敲低減少了MET致癌基因以及其他MAPK相關(guān)基因的表達，損害BRAF樣甲狀腺癌細胞系的細胞增殖、遷移和侵襲性。因此，作者用數(shù)據(jù)證實了lncRNA在腫瘤中的致癌性，提供了新的lncRNA-COMET的新證據(jù)，其可維持腫瘤細胞的存活和增殖，并有助于甲狀腺乳頭狀癌的MET驅(qū)動的侵襲。

材料和方法

RNA-seq數(shù)據(jù)分析，鑒定新的lncRNA。

Fish、RT-PCR、qPCR、RNAi、存活率及凋亡檢測、克隆形成及增殖檢測、細胞侵襲檢測、Western Blot。

研究結(jié)果

1、基于RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定乳突狀甲狀腺癌（PTC）中的新lncRNA?

為了探索PTC中BRAF和RAS樣特異性lncRNA模式，首先在最近發(fā)表的來自22個甲狀腺活組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)集中建立了從頭轉(zhuǎn)錄組裝的計算工作流程，定義一個新的PTC模型轉(zhuǎn)錄組。大于200nt低編碼潛能且與已注釋基因位點無重疊的轉(zhuǎn)錄本鑒定出454個新的lncRNA。與蛋白質(zhì)編碼基因類似，已知和新發(fā)現(xiàn)的lncRNA在患者和對照之間具有顯著差異的表達水平（FDR <0.05）。202個lncRNAs的表達在BRAF和RAS樣PTC之間存在顯著差異（其中77個在BRAF樣PTC中過表達，125個低表達），其中60個未在公共數(shù)據(jù)庫中注釋（圖1D和1E;FDR <0.05）。因此，為鑒定尚未注釋的lncRNAs ：i）在PTC中異常表達，ii）在BRAF-和RAS樣亞組之間差異表達，iii）在附近定位和iv）與已知癌癥驅(qū)動基因高度相關(guān)，作者使用“最近轉(zhuǎn)錄起始位點”（TSS）方法選擇mRNAs / lncRNAs對。有趣的是，基于這些標準，將COMET（COrrelated-to-MET）鑒定為新的lncRNA，與MET癌基因正相關(guān)（r = 0.7）。

2、COMET：一種新反義lncRNA，在BRAF樣腫瘤中高表達，且由MAPK誘導(dǎo)的細胞質(zhì)lncRNA?

COMET lncRNA比對到染色體7q31.2，且由MET致癌基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來（圖2A），一般認知lncRNA具有低表達，RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示COMET表達顯著低于鄰近的MET癌基因。此外，RNA-Seq還顯示它們都在PTC的BRAF樣亞組中過表達（圖2B），表明Ret和B-Raf蛋白的病理性過度激活有助于它們增加的表達水平。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，根據(jù)常見的體細胞突變（BRAF_V600E，H-，K-和N-RAS在密碼子12,13和61的突變）和RET基因重排對以前工作中的一組更大的獨立樣本（腫瘤n = 50;健康n = 11）分類成BRAF樣（n = 32）和RAS樣（n = 18）亞組。在該獨立隊列中，通過qPCR確認NAT lncRNA COMET及其鄰近癌基因MET在BRAF-與RAS樣PTC和對照樣品中過表達（圖2C）。同樣，分析了甲狀腺癌的公共TCGA外顯子組數(shù)據(jù)（THCA; n = 507），并根據(jù)驅(qū)動基因改變對患者進行了分類。然后分析了這些患者的RNASeq數(shù)據(jù)，甚至在這個獨立且更大的PTC隊列中證實了作者的發(fā)現(xiàn)。

為了驗證COMET表達作為Ret和B-Raf蛋白組成型激活的下游轉(zhuǎn)錄事件，檢測了攜帶BRAF_V600E突變（BCPAP）或RET基因重排（TPC-1）的PTC細胞系中的COMET水平與永生化正常甲狀腺細胞系（Nthy-ori 3-1）的比較 。正如所料，COMET以及MET在BRAF樣細胞系中的表達顯著高于正常細胞（圖3A）; 顯示最高COMET表達水平的TPC-1細胞系用作下一步大多數(shù)表型測定的體外模型。

BRAF樣PTC的特征在于ERK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序的過度激活。這一點促使研究COMET表達是否在MAPK激活下游被誘導(dǎo)。因此，用表皮生長因子（EGF）刺激Nthy-ori 3-1細胞中的RAS-RAF-MEK-ERK途徑。MAPK途徑的誘導(dǎo) – 通過早期p-Erk增加證實（圖3B，右圖） – 隨后COMET水平顯著增加（圖3B，左圖）。相反，使用化學(xué)和遺傳方法抑制BRAF突變的BCPAP細胞系中的組成型活性途徑，通過用vemurafenib阻斷過度活化的B-Raf蛋白（圖3C）或BRAF基因KD（圖3D），顯著降低COMET水平。之后評估了COMET細胞定位，與qPCR偶聯(lián)的RNA分級分析顯示，與內(nèi)參蛋白質(zhì)編碼基因（GAPDH）類似，COMET在細胞質(zhì)RNA部分中具有明顯富集（圖3G）。此外，RNA FISH進一步證實了這種新的NAT lncRNA的細胞質(zhì)定位（圖3H）。

3、COMET lncRNA敲低可以削弱癌基因的表達?

為了預(yù)測COMET的功能并確定其在乳頭狀甲狀腺癌中的潛在生物學(xué)意義，基于共犯原則進行分析。利用基于TCGA的lncRNA圖譜TANRIC，使用Pearson相關(guān)性評估甲狀腺癌樣本中的COMET表達是否與其他基因的表達相關(guān)。與初步發(fā)現(xiàn)一致，用鄰近癌基因MET檢測出最高相關(guān)值（r = 0.88）。此外，對與COMET顯著相關(guān)（FDR <0.05;r≥0.7）的基因進行的通路分析顯示MAPK通路的富集，并且有趣的是，其中一些在來自TCGA的PTC樣品的BRAF樣群中過表達（ 圖4A）。

為進一步闡述新的lncRNA與共表達網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的其他基因之間的功能關(guān)系，在BRAF樣腫瘤細胞中敲低了COMET，并檢測表達水平。如圖4B所示，COMET KD顯著損害網(wǎng)絡(luò)中大多數(shù)基因的表達水平，尤其是AKT3，CREB5和DUSP5。檢測出COMET?KD后MET mRNA和蛋白質(zhì)水平的顯著下降（圖4C）。為了避免由于siRNA對MET表達的脫靶活性引起的任何潛在的混雜效應(yīng)，用相同的COMET特異性siRNA庫評估了轉(zhuǎn)染HEK293細胞系的沉默特異性，其表達MET但不表達COMET 。在COMET KD后沒有檢測出該細胞系中MET癌基因水平的變化，表明COMET特異性siRNA不影響MET癌基因水平。進一步測試了是否可能發(fā)生相互調(diào)節(jié)，即MET KD是否會影響COMET和屬于COMET共表達網(wǎng)絡(luò)的其他基因的水平。值得注意的是，在TPC-1細胞中敲低MET（高達80％），沒有檢測出COMET水平以及COMET相關(guān)基因的任何顯著變化（圖4B），表明COMET 敲低后觀察到的基因表達水平降低與MET無關(guān)。

此外，為了探索COMET lncRNA及其鄰近癌基因MET的共調(diào)控，評估了MET誘導(dǎo)刺激是否也能觸發(fā)COMET lncRNA表達。因此，關(guān)注了已知誘導(dǎo)MET表達的兩種刺激，即缺氧和肝細胞生長因子（HGF）治療。與在常氧條件下生長的細胞相比，在低氧條件下生長的TPC-1顯示COMET水平增加2倍（圖4D），揭示缺氧介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也影響COMET表達。同樣，用膜c-Met受體配體HGF急性刺激Nthy-ori 3-1也誘導(dǎo)COMET lncRNA水平的增加（圖4E）。值得注意的是，用HGF處理也誘導(dǎo)FOSL2表達，進一步表明其在COMET調(diào)節(jié)中的作用。

4、COMET 敲低抑制細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，且COMET沉默影響甲狀腺癌細胞的侵襲遷移。并在體外評估了COMET靶向治療的潛力?

由于COMET KD引起c-Met水平的相關(guān)下降，以及甲狀腺癌細胞中其他MAPK相關(guān)癌基因表達水平的顯著降低，進一步研究了COMET KD對腫瘤細胞的表型效應(yīng)。為此在不同時間點測量了COMET KD后TPC-1細胞系的細胞活力和增殖能力。有趣的是，與對照無關(guān)轉(zhuǎn)染的細胞相比，COMET-KD活細胞的百分比顯著降低至~40％（在72小時）（圖5A）。通過細胞增殖測定檢測COMET-KD顯著降低細胞增殖（圖5B）。此外，為了進一步了解COMET如何調(diào)節(jié)甲狀腺癌細胞的細胞生長，通過測量半胱天冬酶3和7的活性驗證了COMET KD是否能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。如圖5C所示，沉默24小時后COMET KD顯著增加凋亡TPC的數(shù)量 。最后，為了驗證COMET KD是否在體外影響甲狀腺腫瘤細胞的致瘤潛力，檢測了COMET-KD TPC-1和對照細胞的克隆形成能力。如圖5D所示，在菌落的數(shù)量和大小方面，COMET沉默顯著影響甲狀腺癌細胞的致癌能力。

考慮到COMET沉默對c-Met蛋白的影響以及在腫瘤侵襲性生長過程中的主要作用，進一步探討了COMET KD對甲狀腺癌細胞遷移和侵襲性的影響。如圖6A和6B所示，COMET敲低（高達40％）顯著降低TPC-1細胞的遷移和侵襲能力。因此，在COMET KD腫瘤細胞中顯示出上皮 – 間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）標記波形蛋白（mRNA和蛋白質(zhì)）的顯著較低表達，而沒有任何N-鈣粘蛋白表達的變化（圖6C）?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持甲狀腺中新鑒定的COMET lncRNA的體外致癌作用，極具表明這種性質(zhì)至少部分地依賴于其對MET和MAPK相關(guān)癌基因表達水平的調(diào)節(jié)活性。

據(jù)報道，受體酪氨酸激酶（RTK），特別是c-Met受體的激活是腫瘤細胞逃避vemurafenib（VMR，維莫非尼）介導(dǎo)的突變體B-Raf蛋白抑制的機制。由于作者數(shù)據(jù)支持COMET可作為MET新的調(diào)節(jié)劑，猜測它是否也可能作用于BRAF突變的腫瘤細胞中的vemurafenib反應(yīng)機制。首先，與TPC-1細胞類似，評估COMET沉默對BRAF_V600E突變的BCPAP細胞系的生存力（高達50％）具有強烈影響（圖6D），伴隨MET水平的下降。當用VMR處理BCPAP時，也表現(xiàn)出了類似的效果（高達60％的細胞存活率降低）。因此，將敲低COMET的BCPAP細胞暴露于VMR，以評估組合治療是否可發(fā)揮累加效應(yīng)。有趣的是，圖6D中數(shù)據(jù)表明，與對照細胞（即僅用VMR處理和/或用對照siRNA轉(zhuǎn)染的細胞，圖6D）相比，COMET敲低的 BCPAP細胞具有顯著增強的VMR敏感性，表明在BRAF_V600E突變腫瘤中COMET是提高化療的新靶標。

小結(jié)

文章使用de novo發(fā)現(xiàn)方法分析RNA測序數(shù)據(jù)，鑒定lncRNA并定義注釋的lncRNA在腫瘤亞型中的特異性。其中，鑒定了COMET（COrrelated-to-MET），一種天然反義轉(zhuǎn)錄物，在含有BRAF_V600E突變或RET基因重排（即BRAF樣腫瘤）的癌癥中高表達，并誘導(dǎo)下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。在乳頭狀甲狀腺癌中，COMET表達與MET表達高度相關(guān)，且與MAPK途徑的不同致癌基因共表達。COMET的降低導(dǎo)致該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)基因的表達降低，包括MET癌基因。COMET沉默抑制了攜帶BRAF_V600E體細胞突變或RET癌基因重排的腫瘤細胞的活力和增殖，并顯著降低了腫瘤細胞的運動性和侵襲性。此外，COMET的沉默顯著增加了對vemurafenib（一種突變的B-raf的常見抑制劑）的敏感性?？偟膩碚f，研究結(jié)果表明COMET特別是在BRAF突變和MET誘導(dǎo)的乳頭狀甲狀腺癌中可作為一種基于藥物改善癌癥治療的新靶點。

參考文獻

Esposito R, Esposito D, et al. Oncogenic properties of the antisense lncRNA COMET in BRAF- and RET-driven papillary thyroid carcinomas.Cancer Research,2019.

 

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