1.?單細(xì)胞RNAseq分析揭示了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞不同亞群的存在

Fig.1 ?CAFs表型和功能的異質(zhì)性

為了更深入地了解CAFs在腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性，作者對4T1小鼠乳腺癌基質(zhì)富集的樣品（一種具有高基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)和免疫排斥的腫瘤模型）進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞缺乏內(nèi)皮(Pecam1，編碼CD31)和造血(Ptprc，編碼CD45)細(xì)胞標(biāo)記物,以及間質(zhì)基因如Thy1和Fap的表達(dá)。為了進(jìn)一步表征腫瘤成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄多樣性，隨后通過t-SNE等方法預(yù)測了CAFs的構(gòu)成，揭示了四個(gè)離散的亞簇的共存及每個(gè)CAF亞群的獨(dú)特特征(圖1)且存在功能差異性。同樣，最近在人類胰腺癌和乳腺癌的成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，這表明不同的小鼠和人類腫瘤類型存在相似性。

為區(qū)分每個(gè)CAF群體的基因及其作用，我們進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。通過對四個(gè)不同亞群的基因進(jìn)行分析，在每種類型的CAFs中鑒定出36-143個(gè)基因特異性上調(diào) (圖1g)。亞群1在炎癥和免疫相關(guān)通路中顯著富集，表明這一簇可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的活性從而具有重要的免疫調(diào)節(jié)能力。亞群2中描繪了與ECM沉積和相互作用相關(guān)的通路特征(圖1g)，表明這些細(xì)胞可能在腫瘤框架的基質(zhì)組成中發(fā)揮重要作用。亞群3被發(fā)現(xiàn)富集與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的通路，以糖酵解和碳代謝特征(圖1g)。最后，亞群4被細(xì)胞周期相關(guān)的特征所支配(圖1g)，并表達(dá)許多與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因?？傊@些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了CAFs之間的異質(zhì)性，表明特定的成纖維細(xì)胞亞群通過非冗余功能影響腫瘤生長。根據(jù)觀察到的表型和功能亞群特異性特征，這四個(gè)描述的亞群隨后被稱為炎性CAFs (iCAFs，亞群1)、典型肌成纖維細(xì)胞(myCAFs，亞群2)、VEGF + CAFs (vCAFs，亞群3)和增殖型CAFs (prCAFs，亞群4)。

3.?TGFβ-阻斷劑擾亂腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞活性

?Fig.2 ?TGFβ中和作用調(diào)節(jié)TME中的CAF功能

在腫瘤微環(huán)境中，因CAF群體在表型和功能上具有不同但彼此之間共存，所以提出了亞群特異性特征可能來源于對微環(huán)境的替代反應(yīng)的一種可能性。與這一假設(shè)相一致的是，最近來自胰腺癌的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了不同的生長因子可能導(dǎo)致腫瘤中CAFs的多樣化。其中，TGFβ被認(rèn)為在形成CAF的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，特別是考慮到它與肌成纖維細(xì)胞分化的聯(lián)系和在腫瘤及其他纖維化疾病，以及抗腫瘤免疫中的功能。對TGFβ配體、受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的分析顯示，不同CAF亞型的表達(dá)模式不同(圖2a)，這進(jìn)一步證實(shí)了TGFβ對不同CAF群體的影響可能不同。特別是，編碼TGFβ蛋白的基因主要由Acta2 +亞群表達(dá)(myCAFs、vCAFs和prCAFs)，表明這些CAF群體可能構(gòu)成TME中TGFβ的主要成纖維細(xì)胞來源。通過對每個(gè)CAF亞組中建立的TGFβ應(yīng)答信號進(jìn)行分析，證實(shí)iCAFs中TGFβ誘導(dǎo)的信號水平較低(圖2b)。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)促使我們研究TGFβ-阻斷劑在體內(nèi)對CAF表型和功能的相對影響。為此，6周齡雌性小鼠接種4T1腫瘤細(xì)胞，隨后用TGFβ阻斷抗體或同型對照處理，研究設(shè)計(jì)如圖2c所示。結(jié)果表明這種腫瘤進(jìn)展的延遲似乎不是由抗TGFβ對腫瘤細(xì)胞的直接作用引起的，更可能是TGFβ阻斷后微環(huán)境變化的結(jié)果。事實(shí)上，使用TGFβ中和抗體可導(dǎo)致整體基因表達(dá)的顯著差異，這在對大量冷凍腫瘤RNAseq分析中得到證實(shí)(圖2f)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，我們通過分析與膠原沉積和纖維化相關(guān)的基因特征，描述了抗tgfβ治療小鼠腫瘤中整體促纖維化程序的顯著減少(圖2h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明靶向TGFβ影響了腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。

4.?TGFβ-阻斷劑改變腫瘤膠原沉積和網(wǎng)狀纖維的形成

?Fig.3 ?TGFβ-中和作用影響腫瘤ECM結(jié)構(gòu)

根據(jù)觀察到的基因表達(dá)變化，作者利用冷凍保存的腫瘤從同型或抗tgfβ處理小鼠切片，染色和共聚焦顯微鏡成像等方法確定了TGFβ-阻斷是否對構(gòu)成腫瘤建筑框架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷。Acta2表達(dá)的鏡像變化，肌成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的顯著改變，細(xì)長的紡錘形細(xì)胞稀少等揭示了瘤內(nèi)結(jié)構(gòu)組織的顯著變化，表明TGFβ阻斷抗體處理小鼠的高網(wǎng)狀纖維網(wǎng)絡(luò)丟失(圖3a)。通過對全器官的斷層掃描，進(jìn)一步證實(shí)了膠原骨架形成的整體損傷，如圖3b所示。單細(xì)胞RNAseq分析結(jié)果表明基因的數(shù)量受anti-TGFβ治療明顯更大 (圖3 c),也與先前的結(jié)果一致。

5.?TGFβ-阻斷導(dǎo)致myCAFs的丟失和CD73 +成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)

Fig.4 ?TGFβ阻斷劑可以消除肌成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)CD73^?+ CAFs的擴(kuò)張

考慮到TGFβ阻斷是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞活性和腫瘤基質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的主要結(jié)果，作者隨后通過測定TGFβ中和作用在CAF各亞群中誘導(dǎo)的相對轉(zhuǎn)錄變化確定了TGFβ是否對離散CAF亞群產(chǎn)生不同的影響。正如預(yù)期的那樣，TGFβ中和誘導(dǎo)了CAF基因整體表達(dá)程序的顯著變化，這可以從接受TGFβ中和抗體的小鼠t-SNE空間的CAF總體群體的視覺轉(zhuǎn)移中看出(圖4a)。通過對這些CAFs進(jìn)行亞聚，可以觀察到myCAFs和vCAFs明顯減少(圖4b, c)，這表明這些亞群可能對腫瘤微環(huán)境中的TGFβ特別敏感。流式細(xì)胞分析α- sma表達(dá)的CAFs頻率也顯示肌成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖4d)，提示TGFβ-阻斷劑可能優(yōu)先靶向腫瘤相關(guān)的肌成纖維細(xì)胞。

?Fig.5 ?ilCAFs表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄組特征

值得注意的是，在TGFβ-阻斷下肌成纖維細(xì)胞的丟失與一種獨(dú)特的CAFs(后來被稱為干擾素許可的CAFs, ilCAFs，圖4b, c為紫色)的出現(xiàn)形成對比，揭示了腫瘤微環(huán)境更廣泛的可塑性。ilCAFs很容易從其他CAF亞群中區(qū)分出來，因?yàn)榕c外切核苷酶Nt5e的基因及編碼的蛋白CD73上調(diào)相關(guān)(圖4f)。

目前尚不清楚，ilCAFs是來自現(xiàn)有的肌成纖維細(xì)胞的編程，還是在TGFβ信號缺失的情況下來自間葉細(xì)胞祖細(xì)胞的另一種軌跡。雖然轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)的偽時(shí)間分析預(yù)測了CAF亞群之間不同的分化軌跡(圖4h)，但ilCAFs和myCAFs仍然可能代表同一現(xiàn)存CAF群體的兩種功能狀態(tài)。需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證這一假設(shè)，并牢固地建立每個(gè)CAF集群的譜系關(guān)系。

6.?TGFβ-阻斷劑生成的成纖維細(xì)胞是ilCAFs

為了獲得關(guān)于新鑒定的CAF亞群功能特性的更多信息，作者研究了這類亞群的轉(zhuǎn)錄特征。然而，對ilCAFs中差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，在干擾素(IFN)信號控制下許多鳥苷晚結(jié)合蛋白(Gbp)家族成員發(fā)生富集(圖5b)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，在區(qū)分ilCAFs與其他CAF亞群的基因中， ilCAFs中IFN信號反應(yīng)上調(diào)，IFN水平調(diào)控的通路增強(qiáng)，包括抗原加工和展示(圖5c)。編碼MHC蛋白和MHC相關(guān)分子的基因在ilCAFs中高表達(dá)(圖5b-d)。體內(nèi)TGFβ-阻斷后，在CAFs中檢測到MHCII蛋白上調(diào)(圖5e)，也發(fā)現(xiàn)ilCAFs在腫瘤內(nèi)對指導(dǎo)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用(圖5b)。

為了確定區(qū)域祖細(xì)胞和分泌物的差異是否會(huì)影響基質(zhì)微環(huán)境，我們分析了原位4T1腫瘤對TGFβ中和的反應(yīng)。與4T1 s.c.類似，TGFβ-阻斷劑輕度延遲了原位4T1腫瘤進(jìn)展。在原位腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了4T1 s.c.腫瘤中描述的相同細(xì)胞群，并增加了一群以Krt18和Slpi等基因表達(dá)為特征的乳腺細(xì)胞。在蛋白質(zhì)水平上，也與s.c.模型數(shù)據(jù)有明顯相似之處。在抗TGFβ治療的原位腫瘤中，CAFs中α- SMA染色明顯缺失，CD73同時(shí)上調(diào)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TGFβ-阻斷劑對人CAF動(dòng)力學(xué)的影響，我們利用單細(xì)胞RNAseq測試了人類結(jié)直腸癌(MSS-CRC)樣本上的TGFβ-中和抗體。對CAFs中調(diào)控差異最大的基因分析揭示了與4T1腫瘤中產(chǎn)生的觀察結(jié)果的相似性。特別是，治療24小時(shí)后，已經(jīng)檢測到與成纖維細(xì)胞活性和ECM相關(guān)的基因下調(diào)，指出人類CAFs中肌成纖維細(xì)胞特征的減少。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，TGFβ-阻斷可導(dǎo)致小鼠和人類腫瘤成纖維細(xì)胞的重塑，暴露了一種獨(dú)特的CAF群體的誘導(dǎo)，其特征是對IFN的明顯反應(yīng)和相當(dāng)大的免疫調(diào)節(jié)潛能。

7.?TGFβ-阻斷劑增強(qiáng)T細(xì)胞的浸潤和激活

?Fig.6 ?TGFβ-阻斷劑促進(jìn)T細(xì)胞浸潤和激活

TGFβ-中和后CAF重塑，特別是具有潛在T細(xì)胞調(diào)節(jié)活性的CAF亞群的出現(xiàn)，促使我們確定TGFβ-阻斷對建立抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響。由于ilCAFs中T細(xì)胞趨化分子基因表達(dá)升高，CD8免疫組化染色顯示細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤在治療組之間存在較大差異(圖6a)。流式細(xì)胞分析證實(shí)了TGFβ-阻斷作用下細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量的增加(圖6c)，支持TGFβ-阻礙可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞反應(yīng)的全面覺醒。在單細(xì)胞水平上也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。為了評估這種與浸潤T細(xì)胞組織分布相關(guān)的激活程度，我們隨后通過空間轉(zhuǎn)錄組分析生成了與T淋巴細(xì)胞存在及其活性相關(guān)基因的腫瘤路圖。

8.?TGFβ中和增強(qiáng)體內(nèi)PD1免疫治療的療效

?Fig.7 ?TGFβ阻斷劑增強(qiáng)了PD1免疫療效