?人生最悲哀的事兒是什么呢？我想對于走在科研道路上的您，莫過于千辛萬苦準備的樣品，興高采烈的送去做測序。等來的卻是遠方傳來的噩耗，我方核酸因取樣時處理不當，現(xiàn)已“陣亡”。小編雖是各位老師科研道路上的甲乙丙丁，但卻感同身受。所以整理了這篇軟文和大家共同分享一下樣品制備方面的知識，以期能夠?qū)Υ蠹业目蒲杏兴鶐椭?/p>

植物組織的采集及處理

被子植物6大器官模式圖

1、在與研究目的不沖突的前提下，盡量選取新鮮、幼嫩、生長狀態(tài)良好的組織部位。植物組織越幼嫩新鮮所含的次生代謝產(chǎn)物就越少，隨著植物組織的逐漸成熟，次生代謝產(chǎn)物的含量會逐漸增多，而次生代謝產(chǎn)物的存在會影響核酸的提取效果，次生代謝產(chǎn)物越多，核酸提取越困難，得率也越低。

2、如果植物組織表面污漬較多，在采集之前應(yīng)迅速用預(yù)冷的純凈水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干組織表面殘留液體。

3、將處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中。

4、建議10min中內(nèi)（越快越好）置于液氮中冷凍1h以上，然后轉(zhuǎn)移至-80℃長期保存，干冰運輸。

動物組織的采集及處理

1、液氮速凍法詳細流程:

1）提前準備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）

2）活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；

3）迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4）如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大小）

5）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標注編號。

6）立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存

7）干冰運輸。

2、TRIzol法(僅限于RNA類產(chǎn)品):

1）如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務(wù)必先進行液氮研磨破碎，然后溶于 TRIzol 中組織樣品切勿過量；

2）震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送。

3、RNAlater??Tissue Collection保護液法(僅限于RNA類產(chǎn)品):

1）用RNAlater??Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊。

2）如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater??Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存；

3）RNAlater??Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater??Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存；

4）保存于RNAlater??Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；

5）一般來講，生物樣本保存于RNAlater??Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater??Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存。

微生物樣品的采集及處理

細菌

注意：所有菌類樣品必須分離好菌體或菌絲送樣，切勿連帶培養(yǎng)基一起寄送，帶培養(yǎng)基的菌體無法提取。

1）顯微鏡下觀察細菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的細菌。

2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min。

3）棄掉培養(yǎng)基，將細菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸。

真菌

真菌的形態(tài)多樣，一般分為單細胞和多細胞真菌，酵母菌屬于單細胞真菌，而霉菌和蕈菌（大型真菌）都屬于多細胞的真菌。

單細胞真菌

單細胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×10⁷個，以 5×10⁶-1× 10⁷個為宜。您要做的項目要求送樣量較大時，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨保存。

1）顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌。

2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。

3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

細胞樣品的采集及處理

貼壁細胞

一次提取反應(yīng)所需細胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運輸。

1、從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細胞，顯微鏡下觀察細胞，確定生長狀態(tài)良好（正常細胞融合度在80 %左右）;

2、棄去培養(yǎng)基，向細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入 5mL PBS（RNase free）， 清洗一次后棄盡PBS；

3、加入1mlPBS（RNase free）重懸后將細胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

4、離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

運輸方式：干冰運輸。

*TRIzol 裂解法（僅限于RNA類產(chǎn)品）：

離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol；細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

*注：判斷裂解液加入量是否合適的標準可以根據(jù)細胞溶解物的黏度來判斷。在細胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解。

液氮速凍法：

離心收集的細胞直接液氮速凍，速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

懸浮細胞

一次提取反應(yīng)所需細胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運輸。

1、確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）；

2、棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

3、離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

運輸方式：干冰運輸。

TRIzol 裂解法（僅限于RNA類產(chǎn)品）：

離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol；細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

*注：判斷裂解液加入量是否合適的標準可以根據(jù)細胞溶解物的黏度來判斷。在細胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解。

液氮速凍法：

收集的細胞直接液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

全血樣品的采集及處理

RNA類全血樣品制備

1、采血管選擇

采集血液進行檢測面臨的一個主要問題就是細胞內(nèi) RNA 的不穩(wěn)定性，RNA 在采血后數(shù)小時內(nèi)便會迅速降解。此外，某些種屬的 RNA 在采血后會通過基因誘導(dǎo)在體外增加。體外RNA 降解和基因誘導(dǎo)均可導(dǎo)致體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目低估或高估。

BD 公司的 PAXgene 血液 RNA 管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它能夠減少體外 RNA 的降解，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，適用于人和靈長類動物全血樣品制備，對于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。

2、采集血液

使用PAXgene血液RNA管前請仔細閱讀產(chǎn)品說明書，以便進行正確的操作。如果PAXgene血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過程中所用的采血器內(nèi)能被血液預(yù)灌注；否則 PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管（PAXgene 血液 RNA管內(nèi)的負壓設(shè)計可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）。

采血后應(yīng)立即將 PAXgene 血液 RNA 管輕輕地顛倒 8-10 次，以確保管內(nèi)保護劑和血液充分混合均勻。

3、保存、運輸

將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個月。大體積干冰運輸。

DNA類全血樣品制備

1、用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2、上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中，轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3、干冰運輸

注：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

制備常見問題匯總

組織保存管的選擇

所有組織樣品務(wù)必根據(jù)質(zhì)量多少選擇使用下圖的螺紋管保存，嚴禁直接裝入密封袋或錫箔紙（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

組織送樣量要求

建議送樣量適用于95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當增加送樣量，比如植物果實、根等。送樣量過少或過多均不利于提取實驗，下限為建議量的一半，上限為建議量的3倍。隨著技術(shù)發(fā)展，當前大部分產(chǎn)品建庫起始量較低，不需要太多組織，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險。

1、RNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

2、二代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

3、三代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

曾經(jīng)有一份絕世的“武林秘籍”放在我面前，沒有珍惜，等失去的時候才追悔莫及，人世間最痛苦的事莫過于此。但人生最難得的，莫過于“不幸之中有萬幸”，艱難之中的那一絲曙光。小編特此奉上這本“武林秘籍”以期能夠?qū)Ω魑焕蠋煹目蒲杏兴鶐椭?/section>